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这是RAW-BioSAXS教程的第二篇，本教程涵盖了根据SAXS数据计算分子量的基本原理和操作。

概述

有许多方法可以根据SAXS数据计算分子量。RAW程序支持四种最常用的方法：

Ø 利用绝对强度I(0)计算分子量[1]。

Ø 通过与参考标准进行比较计算分子量[1]。

Ø 利用Porod参数计算分子量[2]。

Ø 利用体积相关性计算分子量与[3]。

ATSAS软件还支持两种其他方法，如果安装了ATSAS，RAW将显示这些方法：

Ø 通过将散射与已知结构进行比较来估算分子量[4]。

Ø 通过贝叶斯推论从其他分子量方法计算分子量[5]。

所有这些方法都有优缺点，要使用和信任哪一种方法在一定程度上取决于数据的详细信息。无论如何，计算分子量对于验证样品的低聚状态很重要。

为什么要计算分子量？

SAXS分子量计算并非十分准确，通常的经验法则是不确定性约为10％（或更高）。因此，不应使用SAXS来确定样品的分子量，诸如多角度光散射（MALS）之类的方法更加准确。根据SAXS数据计算分子量的主要原因是要确定溶液中蛋白质的低聚状态。特别是如果正在研究可以形成同二聚体或更高阶低聚物的系统，则SAXS分子量计算应足够准确，以表明要测量的低聚物状态。因此，分子量是一种重要的诊断方法，可用于验证溶液中的成分。

如何计算分子量？

因为有很多方法可以根据SAXS数据计算分子量，所以这里仅列出上面提到的方法的简短摘要。一般而言，这些方法可分为两类：浓度依赖型和浓度无关型。依赖于浓度的方法需要知道SAXS池中样品的浓度，这通常意味着它们与SEC-SAXS测量不兼容。浓度无关的方法不需要了解浓度，因此对于SEC-SAXS测量非常有用。

通过绝对强度I(0)计算分子量

SAXS数据通常置于绝对比例上，因此强度值具有单位（通常为cm-1）。这意味着I(0)值可以直接与样品中的电子数量、样品的浓度和对比度相关[6]。如果已知样品的浓度和对比度，则可以计算电子总数，然后将其用于确定样品的分子量。这种方法的准确性可以通过测量或计算蛋白质微分比容（例如，使用MULCh）来提高。如有必要，调整样品和缓冲液的电子密度也会提高准确性。分子量计算公式如下：

其中MW是分子量，c是浓度，NA是阿伏伽德罗常数，ΔρM是单位质量的散射对比度。

在文献[1]中评估了此方法的准确性，发现大多数蛋白质的误差均<〜10％。

通过与标准品比较计算的分子量

零角处的散射I(0)与大分子的分子量、溶液中大分子的浓度和对比度成正比。如果测量了已知分子量和浓度的参比样品，则可用于校准具有已知浓度（假设参比样品与样品的对比度一致）的任何其他散射曲线的分子量[1]。分子量计算如下：

其中MW是分子量，c是浓度，下标m和st分别表示目标大分子和标准品的量。

利用波罗德(Porod)体积计算分子量

Porod体积名义上是大分子在溶液中的排除体积。可以直接从散射曲线计算得出，首先计算Porod不变量：

其中Qp是Porod不变量。然后计算Porod体积为：

其中I(0)是零角度的散射。一旦确定了体积，就可以通过简单地乘以大分子的密度来确定分子量。

由于Qp由0到∞的积分确定，因此实际积分必须以某种方式近似。有多种方法，包括在ATSAS datmw程序中实现的“Porod”和“ Qp”方法。RAW使用文献[2]中所述的SAXSMoW 2方法，该方法根据散射曲线中可用的数据范围将校正因子应用于Porod体积。然后，将平均蛋白质密度用于计算分子量。如果已知大分子更精确的密度，则可以提高该方法的准确性。

在文献[2]中，他们发现球蛋白的分子量计算中值不确定度为12％。相比之下，在[5]中，他们使用大量的模拟曲线测试集发现该方法的分子量中值高3％，而该方法的中值绝对偏差为5％。具有模拟噪声的数据的不确定性较高。尽管存在异常值，但对于大多数系统而言，分子量不确定性约为10％，这似乎是合理的。

从相关体积计算分子量

在文献[3]中，他们将相关体积定义为：

他们凭经验发现比率Vc2/ Rg与分子量成对数比例，公式如下：

其中c和k是根据理论散射曲线的拟合结果凭经验确定的常数。他们发现蛋白质和RNA的常数不同。对于蛋白质，c = 0.1231和k = 1，而对于RNA，c = 0.00934 和k= 0.808（注意：c和k在原始论文中定义略有不同）。

在[3]中，他们发现，分子量分布的理论不确定性约为理论值的5％，而实验分布的不确定性约为10％。相比之下，在[5]中，他们使用大量的模拟曲线测试集发现该方法的分子量中值低2％，而该方法的中值绝对偏差为7％。具有模拟噪声的数据的不确定性较高。可以合理地说，对于大多数系统，分子量的不确定性约为10％，尽管存在异常值。

与已知结构比较确定分子量

文献[4]描述了一种机器学习方法，该方法基于与PDB中已知结构数据比较，将SAXS数据分为形状类别。通过找到形状和尺寸最接近的结构（方法名称：Shape＆Size），就可以获得样品分子量的估计值。

在[4]中，他们发现，对于用于测试的理论散射曲线，该方法计算的分子量在90％的测试数据的预期值的10％范围内。在[5]中，他们发现对于测试数据集，分子量中值是正确的，中值绝对偏差是4％。同样，可以合理地说，对于大多数系统，此方法的分子量不确定性约为10％，尽管存在异常值。

贝叶斯方法推断分子量

文献[5]描述了一种利用贝叶斯推论来计算分子量的方法，该方法是根据Porod体积，相关体积以及与已知结构方法的比较来计算分子量。本质上，它需要一个庞大的理论散射曲线测试数据集，使用每种方法计算每种分子的分子量，然后为每种方法创建概率分布，以描述在给定真实分子量的情况下获得特定计算分子量的概率。将所有方法中的概率结合在一起，从而估算出最可能的分子量。

他们发现，对于所使用的理论散射曲线，此方法的分子量中值准确，中值绝对偏差为4％。总体而言，他们报告说它比任何一种单独的方法都更准确。可能是此方法的不确定性~5％通常比其他方法的10％小。

不同分子量计算方法的优缺点是什么？

每种方法都有各自的优缺点，并且对于某些类型的数据而言往往会更好。每种方法都需要对I(0)进行良好的测定，而所有与浓度无关的方法都需要Rg，这通常意味着在所有情况下都需要良好的吉尼尔拟合。同样，文献[5]指出所有与浓度无关的方法都不太适用于平面和环状蛋白质。

通过绝对强度I(0)计算分子量

优点：

1、当所有参数已知时，可以非常准确。

2、具有正确的参数时可用于蛋白质或RNA/DNA。

缺点：

1、需要准确的样品浓度。

2、需要精确的绝对强度。

3、最好大分子的散射对比度已知。

4、最好知道微分比容。

通过与标准品比较计算的分子量

优点：

1、对于相同条件下的相似标准品和样品，可以非常准确。

2、具有正确的标准品可用于蛋白质或RNA/DNA。

缺点：

1、需要准确的样品浓度。

2、参考标准品应具有与样品相同的散射对比度（即在相似的缓冲液中）。

3、标准品和样品应具有相似的形状（即相同的微分比容）。

利用波罗德(Porod)体积计算分子量

MoW方法请参考文献[2]。

优点：

1、适用于大多数分子形状[5]。

2、当数据的信噪比合理时，比相关体积方法更准确[5]。

缺点：

1、当大分子具有柔性或在溶液中延展时，应该小心（尽管[5]发现情况并非总是如此）。

2、在某些情况下可能需要调整蛋白质密度（默认值：0.83 kDa / nm3），如果大分子不是蛋白质，则会失败。

3、对缓冲液扣减敏感。

从相关体积计算分子量

优点：

1、当信噪比较低时，比其他方法更准确[5]。

2、有扣减有误差时，比其他方法更准确[5]。

3、对于柔性或延展的大分子应准确[3]（尽管[5]发现并非总是如此）。

4、适用于蛋白质和RNA/DNA。

缺点：

1、对于高信噪比数据，其准确性不及其他方法[5]。

2、对于延展大分子，其准确性不如Porod体积MoW方法[5]。

3、小于15-20 kDa的大分子具有较大的不确定性（根据经验，以及经验系数是从20 kDa及更大的尺寸范围生成的事实）。

4、对于蛋白质核酸复合物无效。

5、qI(q)的积分必须收敛（请参见下图）。

两个图都显示了qI(q)的积分与q的关系。左图显示积分值收敛的数据，即，随着q的增加，积分值在高q处基本不变。右边的图显示了积分值尚未收敛的数据，即，随着q的增加，积分值在高q时增加。右边的数据无法通过相关体积方法，给出准确的分子量。

与已知结构比较确定分子量

优点：

1、除低信噪比数据外，最准确的独立于浓度的方法[5]。

2、存在扣减错误时相对准确。

缺点：

1、对于柔性系统没有结果。

2、仅适用于蛋白质。

贝叶斯方法推断分子量

优点：在大多数情况下，比单独的与浓度无关的方法更准确[5]。

缺点：

1、遇到大的扣减错误不适用。

2、仅适用于蛋白质。。

常见问题

无法从SAXS数据中获得预期的分子量，该怎么办？

来自良好SAXS数据的分子量具有相对较大的不确定性（通常~10％），对于低信噪比数据可能会严重恶化。如果出现错误，需要采取的措施取决于要确定的内容。

如果确定样品在溶液中是稳定的（不易于聚集/降解），或者有证据表明样品全部处于一种状态（例如，SEC-SAXS实验中的一个尖锐的洗脱峰），如果您的分子量有一点偏差是没关系的。在这种情况下，如果只是试图确定样品的低聚状态。能清楚地区分，那就可以；不能，则需要使用其他方法测量分子量。

如果样品在溶液中不稳定（易于聚集/降解），则需要使用另一种方法测量样品的分子量。好的方法包括多角度光散射（MALS）或分析超离心（AUC）。最好的方法是进行SEC-MALS-SAXS实验，在与SAXS数据相同的洗脱液中收集MALS数据，从而消除有关样品在MALS和SAXS测量之间的变化问题。

需要确定“小分子”是否绑定到“大分子”，或者想确定结合化学计量，可以用SAXS做到吗？

这在一定程度上取决于分子的相对大小。但是，如果“小分子”物体很小，例如~20 kDa，而“大分子”物体很大，例如~250 kDa，则SAXS数据不太可能可靠地确定绑定和未绑定之间的差异（250 kDa或270 kDa），或 1：1和2：1结合（270 kDa或290 kDa）。在这种情况下，应该进行分子量的其他表征。最好的方法是进行SEC-MALS-SAXS实验，在该实验中以与SAXS数据相同的洗脱液收集MALS数据。

参考文献

1. Mylonas, E. & Svergun, D. I. (2007). J. Appl. Crystallogr. 40, s245–s249. DOI: 10.1107/S002188980700252X

2. Piiadov, V., de Araújo, E. A., Oliveira Neto, M., Craievich, A. F. & Polikarpov, I. (2018). Protein Sci. 2–22. DOI: 10.1002/pro.3528

3. Rambo, R. P. & Tainer, J. A. (2013). Nature. 496, 477–481. DOI: 10.1038/nature12070

4. Franke, D., Jeffries, C. M. & Svergun, D. I. (2018). Biophys. J. 114, 2485–2492. DOI: 10.1016/j.bpj.2018.04.018

5. Hajizadeh, N. R., Franke, D., Jeffries, C. M. & Svergun, D. I. (2018). Sci. Rep. 8, 7204. DOI: 10.1038/s41598-018-25355-2

6. Orthaber, D., Bergmann, A. & Glatter, O. (2000). J. Appl. Crystallogr. 33, 218–225. DOI: 10.1107/S0021889899015216