內參是western blot法非常重要而必須的部分。它保證瞭目的蛋白表達量的相對多少。內參是指由細胞中管傢基因編碼的蛋白，其在各組織細胞中的表達相對穩定，因此在測定目的蛋白的相對水平時常用它做對照物。

一、內參介紹

哺乳動物細胞中常用的內參很多且分佈廣泛：

全細胞或細胞漿中---tubulin (微管蛋白), actin (肌動蛋白), GAPDH,等；

細胞核中----Lamin B1, HDAC, PCNA, Histone H3等；

線粒體中----HSP60, COX IV等。

全細胞或胞漿蛋白

（1）肌動蛋白：

肌動蛋白是高度保守的，在脊椎動物中是由六種蛋白組成：α-actin, α1 -actin, β-actin, γ1-actin 和γ2-actin。β-actin和γ1-actin是兩種非肌型肌動蛋白。它們充當微絲的主要組成部分。來源於各種如人、小鼠和雞的β-actin都是相同的。人源β-actin與真菌的同源蛋白有近90%的相同性。人源β-actin與人源肌動蛋白傢族中的其它成員至少有93%是相同的。這些肌動蛋白傢族成員間以及種族間的同源性信息對於抗體選擇和解釋蛋白質印跡條帶是很重要的。 α-actin和β-actin在western blot中一直被用作內參。肌動蛋白在細胞中濃度很高，因此為瞭檢測到肌動蛋白量的任何變化，調整上樣體積和蛋白質印跡操作流程是很重要的。 細胞生長條件的改變會破壞肌動蛋白的合成。有報道表明beta肌動蛋白在蛋白質印跡分析中可能不是一個可靠的內參。beta肌動蛋白也存在於核內，作為染色質重塑復合物的一個組成部分，但不能用於核蛋白樣品的對照。

（2）GAPDH

GAPDH的全稱是甘油醛-3-磷酸脫氫酶。GAPDH是一個管傢基因，在western blot和PCR中都被用作參照。 GAPDH在物種間是高度保守的。例如，人源由335個氨基酸組成的GAPDH其全長有70%與Arabidopsis thaliana中由422個氨基酸組成的同源蛋白是相同的。 它存在於胞漿、細胞核、核周區及膜上。 一項全面的研究表明GAPDH mRNA水平在不同組織類型中有顯著差異，但是相對於年齡和性別而言卻是保持恒定的。缺氧可上調GAPDH的表達，導致GAPDH聚集。因此不能在涉及氧氣的相關研究中作為內參。有趣的是，它是用於治療牛皮癬和多發性硬化癥的免疫調節藥物的靶點，比如富馬酸二甲酯，它可以琥珀酸化和滅活GAPDH的催化半胱氨酸。

（3）tubulin

Tubulin即微管蛋白，分為5種：α, β, γ, δ和ε。α和β微管蛋白組成的異源二聚體是微管的構成組分。 α微管蛋白的亞型包括1a (TUBA1A)、1b (TUBA1B)、1c (TUBA1C)、3c (TUBA3C)、3d (TUBA3D)、3e (TUBA3E)、4a (TUBA4A)和8 (TUBA8)。I類(TUBB)、IIa類(TUBB2A)、IIb類(TUBB2B)、III類(TUBB3)、IVa類(TUBB4A)、IVb類(TUBB4B)、V類(TUBB6)、VI類(TUBB1)和VIII類(TUBB8)都是β微管蛋白的亞型。 γ微管蛋白，γ1(TUBG1)和2(TUBG2)，參與微管的成核和極性排列，並存在於中心體和紡錘體極體中。δ (TUBD1)和ε (TUBE1)微管蛋白往往位於中心粒處，並且是有絲分裂紡錘體的結構部件。微管蛋白在物種間是高度保守的。例如，人源有451個氨基酸的微管蛋白α1a與酵母中由445個氨基酸組成的同源蛋白Tub3p有74%是相同的。α、β, γ的亞型也都是非常類似的。人源α微管蛋白相互間有超過90%的相同性。不同型的微管蛋白也有顯著的同源性。人源α微管蛋白和人源β微管蛋白有40%相同性。α, β, γ微管蛋白都一直被用作內參。微管蛋白是多個藥物的作用靶點，如抗癌藥物紫杉醇（Taxol）、多西紫杉醇、長春堿（vinblastine）和 長春新堿（vincristine），抗痛風劑秋水仙堿（colchicine）和抗真菌藥物灰黃黴素（griseofulvin）。這些藥物都會影響體外和體內的微管蛋白表達。因此有這些藥物作用時內參勿選tubulin。

核蛋白

(1) Lamin B1

核纖層蛋白是核纖層的結構部件，用於支撐核被膜並參與細胞周期中核被膜的解體和再形成。在動物細胞中，3種基因編碼瞭至少7種核纖層蛋白。LMNA基因通過可變剪接編碼A型和C型核纖層蛋白，而LMNB1和LMNB2分別編碼核纖層蛋白B1和B2。B型核纖層蛋白存在於每個細胞。A型核纖層蛋白在原腸胚形成後表達，C型核纖層蛋白的表達是組織特異性的。核纖層蛋白會進行法尼基化和磷酸化等翻譯後修飾，從而調節核纖層的組裝和核纖層蛋白的活性。在核纖層蛋白中，核纖層蛋白B1往往被用作內參。核纖層蛋白B1在物種間是高度保守的。人源核纖層蛋白B1與嚙齒目動物中的同源蛋白有95%的相同性，與果蠅的同源蛋白有36%的相同性。人源核纖層蛋白B1與其它人源核纖層蛋白有50%以上的相同性。 核纖層蛋白B1對於沒有核被膜的樣品是不適合作為內參的。

(2) TBP

TATA結合蛋白，TBP，是在由RNA聚合酶II進行基因轉錄前能特異性結合到TATA框DNA序列的通用轉錄因子。TATA框存在於10-20%的人類啟動子中。TBP的N端有一長串谷氨酰胺（TBP mRNA中的CAG重復），可以調節C端的DNA結合活性。正常人群中TBP N端的谷氨酰胺數量是不盡相同的（25至42個重復），並且在某些病理狀態下會延長至47-63個重復。TBP是高度保守的。人源TBP與嚙齒目動物中的同源蛋白有90%的相同性，與真菌的同源蛋白有超過60-70%的相同性。

(3) PCNA

增殖細胞核抗原，PCNA，是DNA聚合酶delta的一個輔助因子，並且在細胞周期的DNA合成階段（S期）在細胞核內表達。PCNA參與真核DNA復制。PCNA在黑猩猩、狗、牛、大鼠、雞、斑馬魚、果蠅、蚊子、裂殖酵母、芽殖酵母、克魯維酵母（K. lactis）、棉阿舒囊黴（E. gossypii）、稻瘟病菌（M. grisea）、粗糙脈孢菌（N. crassa）、擬南芥和水稻中都是保守的。人源由261個氨基酸組成的PCNA與嚙齒目動物中的同源蛋白有97%的相同性，與酵母中的同源蛋白有36%的相同性。PCNA對於非增殖細胞或經過抗增殖處理的細胞並不是一個好的內參。

線粒體蛋白

(1) VDCA1/孔蛋白（porin）

電壓依賴性陰離子通道，作為一類孔蛋白傢族，構成瞭真核細胞中線粒體外膜上的主要蛋白。在脊椎動物中至少有三種成員（VDAC1、VDAC2和VDAC3）。VDAC1在線粒體外膜和質膜上都有，發揮著不同的功能。它表達於心臟、肝和肌肉組織中。由於可變剪接導致瞭有多種變體。VDAC1基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、雞和斑馬魚中是保守的。人源VDAC1與小鼠的同源蛋白有99%的相同性，與斑馬魚的同源蛋白有85%的相同性。相關例子見 [20] 。

(2) COX4I1

位於線粒體內膜的細胞色素C氧化酶是線粒體電子傳遞鏈中的最後一個酶復合體。該復合體由13個線粒體編碼和核編碼的亞基組成。 細胞色素C氧化酶的亞基IV通常被用作內參。它有兩種亞型（亞型1和2）。它們由兩個核基因編碼（COX4I1和COX4I2）。亞型1是廣泛表達的，亞型2是高度表達於肺部組織的。這兩種亞型在人當中有60%的相同性。亞型I COX4I1被用作內參。人源COX4I1與小鼠的同源蛋白有80%的相同性，與斑馬魚的同源蛋白有63%是相同的。

（部分內容轉引自：

）

二、內參選擇

由於很多抗體公司的內參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。因此，要選擇對應的內參就要遵循相應的原則：

（1）目的蛋白表達部位

胞漿和全細胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等；

胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等；

核膜蛋白：Lamin B（66KD）等；

胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等；

線粒體蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。

（2）實驗環境

有些細胞在某些條件下內參表達會出現異常，使其不適合做內參。比如某些細胞中，由於組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內參。在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內參。在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內參。Lamin B不適合作為胚胎幹細胞的內參，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內參等。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素並查詢相應文獻，在實驗過程中也應該註意如果內參表達出現異常，應考慮這方面因素。

（3）不同的組織特異性

actin 即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其餘兩種廣泛分佈於各種組織中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分佈是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分佈就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論。

內容轉引自：

三、怎樣才能跑出完美的內參條帶?

我們在western blot實驗中可能會遇到內參條帶不齊的情況，那麼是什麼原因造成的呢？

現在我就自己多年的轉印經驗給出可能的原因：

（1）蛋白收集及定量： 首先，自己的蛋白定量是否精準？線性回歸幾個9？（至少要2個）其次，收集蛋白上清時，切記切記：tips不能觸碰到沉淀或吸取少許沉淀！！！因為哪怕是一點點沉淀都會導致該樣品的蛋白濃度不均，嚴重影響蛋白定量的精準性。

（2）上樣時要保證各組蛋白濃度一致，同體積或同質量。同時，小心上樣，避免蛋白丟失，即有些蛋白加到槽外。

（3）轉膜時（濕法或半幹轉法），特別是半幹轉法，務必保證上下層濾紙充分浸泡在轉膜液中，使之達到飽和！濾紙放到轉膜儀上要設法保證濾紙的平整。濾紙與濾紙之間，濾紙與PVDF膜之間盡可能的驅趕氣泡！

（4）抗體：一抗用過3次往後就不要用瞭，直接換新的。內參不齊，其實抗體量不多瞭或孵育時抗體與目的條帶分佈不均也是一個主要原因。記住：遇到這種情況：換新抗體，孵育時抗體及條帶充分接觸且延長孵育時間！

（5）藥物或其他外界因素：上文提到過，使用影響圍觀蛋白的藥物作用細胞，如長春新堿、紫杉醇等不要用tubulin蛋白；在做缺氧相關實驗時不要用GAPDH；有些藥物導致細胞生長發生改變時盡量避免使用actin。其實，當你沒註意這些條件時，發現內參不齊，可以再跑下其他的內參條帶做進一步驗證。

（6）蛋白上樣時，樣品要混勻，特別是做CO-IP實驗蛋白樣品中含珠子的一定要充分混勻，別怕麻煩！

（7）分離好蛋白上清，在加Loading buffer，ddH2O前藥先把金屬浴儀器打開，使其盡快達到預定溫度。然後快速於每個蛋白樣品中加入LB和水。這樣可防止蛋白的繼續降解！！

你掌握瞭嗎？

更多有關分子生物學、細胞生物學、免疫學，論文基金申請寫作，SCI潤色的需求。可私信溝通或V.X聯系：potterlee，信諾金達，專業服務！加速您的實驗進程。