蛋白定量
蛋白定量即蛋白质定量,蛋白质定量根据其目的分为蛋白质的“总定量”和特定蛋白质的“个别定量”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分,为验证细胞裂解是否成功,或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存,需对细胞裂解液进行蛋白定量;为了判定蛋白的产量,需对纯化好的蛋白进行定量;为了将纯化好的蛋白用生物素或报告酶进行标记,同样需要首先对蛋白样品进行定量,以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子,它种类繁多,结构不一,功能各异,分子量相差很大,因此建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析方法很因难。
现测定蛋白质含量的方法有很多:根据物理性质来分有紫外分光光度法;根据化学性质来分有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowary法)、BCA法和胶体金法;根据染色性质有考马斯亮蓝染色法、银染法;根据其他性质有荧光法;其中较为常见的有以下五种。
1 紫外分光光度法
蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280 nm波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与蛋白浓度成正比,故可作为蛋白质定量测定的依据。该方法是最快的蛋白质定量方法,但由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同,如要准确定量则应有待测蛋白质的纯品作为标准来比较,或者知道其消光系数作为参考。另外,不少杂质在280 nm波长下也有—定吸收能力,可能发生干扰,其中核酸(嘌呤和嘧啶)的影响尤为严重。核酸的最大吸收峰是在260 nm,因此若溶液中存在核酸,必须同时测定OD260与OD280,然后根据两种波长的吸收度比值,通过经验公式校正,以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。
优点:
操作简便迅速,且不消耗样品(可以回收),多用于纯化蛋白质的微量测定。
缺点:
(1)当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时,会产生—定误差。
(2)混有核酸时必须分别测定280 nm和260 nm两处的OD值,再按公式推算蛋白质含量。
2 双缩脲法
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热放出一个分子氨后得到的产物。在强堿性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能通过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10 mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
优点:较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。
缺点:灵敏度差,常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。
3 考马斯(Comessie)亮兰结合法
考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。考马斯亮兰能与蛋白质的疏水区相结合,这种结合具有高敏感性,考马斯亮兰G250 的最大光吸收峰在465 nm,当它与蛋白质结合形成复合物时,其最大吸收峰变为595 nm。在一定范围内,考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595 nm下,光密度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。
优点:
(1)操作简便、快速;检测灵敏;重复性好。
(2)显色迅速,约2分钟内可完成染料与蛋白质的结合,所现颜色至少在1小时内是稳定的。
(3)与改良Lowary法相比,干扰物质较少。
缺点:
(1)当样品中存在较大量的SDS、TritonX-100等去垢剂时,显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强堿性时也会影响显色,故必须预先处理样品。
(2)考马斯亮兰G250染液不宜久存,以1-2月为宜。
4 Lowary蛋白定量法
Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展,其原理是:蛋白质溶液用堿性铜溶液处理,形成铜-蛋白质的络合盐,在加入酚试剂后,除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键、堿性铜的显色效果更强烈。因此,Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍,为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强,从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
注意事项
(1)酚试剂只在酸性条件稳定,故当其加到堿性的铜-蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前,还原反应即能发生。
(2)为了保证反应进行完全,反应在25~30℃水浴中进行,反应30 min后准时比色。
(3)避免还原物质干扰本实验。
优点:
微克级高灵敏度定量测定,稳定。
缺点:
(1)受植物体内存在的酚类物质干扰。
(2)去污剂如TritonX-100,SDS,NP-40的浓度超过0.2%时会影响定量结果。
5 BCA法
BCA( Bicinchoninic acid)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowary法蛋白定量相似,即在堿性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。
BCA蛋白定量法需要两种试剂:
试剂A:称取1 g sodium bicinchoninate,2 g Na2CO3,0.16 g酒石酸钠,0.4 g NaOH和0.95 g NaHCO3,定容到100 ml,用NaOH将pH调到11.25。
试剂B:将0.4 g CuSO4•5H2O溶于10 ml水中。
工作液:100份试剂A和2份试剂B混合。
测量方法:取25 μl 标准品加入到200 μl BCA工作液中,37℃或60 ℃孵育30 min,检测562 nm处的吸光度绘制标准曲线。用同样的方法检测蛋白样品的吸光度可算出蛋白样品的浓度。
优点:
(1)灵敏度高,检测浓度下限达到25 μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5 μg,待测样品体积为1-20 μl。
(2)操作简单,快速,45分钟内完成测定,比经典的Lowary法快4倍且更加方便。
(3)测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20,60,80。
(4)在20-200 μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。
(5)检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝蛋白定量法。
(6)经济实用,除试管外,测定可在微板孔中进行,大大节约样品和试剂用量。
缺点:受螯合剂和略高浓度的还原剂(EDTA小于10 mM,DTT小于1 mM,巯基乙醇低于1mM)的影响。
以上是针对全蛋白质的“总定量法”,然而许多实验需要对溶液中特定蛋白进行定量分析,即针对特定蛋白质的“个别定量”。针对特定蛋白定量常用的方法有酶联免疫吸附试验法(ELISA),免疫印迹分析法(WB)和质谱检测(MS)。
1 ELISA
ELISA是溶液中特定蛋白定量的一种常用方法,通常是在96孔板上进行,关键步骤是特定抗原/蛋白的固定。具体来说,ELISA有不同变种。
直接或间接ELISA
特定抗原/蛋白直接吸附到检测板,封闭未被抗原包被的孔板表面,然后在孔板中加入酶标(直接ELISA)或未酶标(间接ELISA)的第一抗体,在测试孔板中,一抗与抗原/蛋白相结合。对于未酶标的第一抗体,加入酶标的第二抗体与第一抗体结合。最后,加入酶底物(通常是四甲基联苯胺TMB或堿性磷酸酶ALP)使溶液发生颜色变化然后使用分光光度计检测。颜色变化与蛋白质浓度是直接相关的。
直接ELISA的优点是速度快,并且没有第二抗体的交叉反应问题,但局限是第一抗体的标记可能是费时和昂贵的。此外,信号放大是最弱的。因此,更常用的是
夹心ELISA
特定抗原/蛋白结合在孔板表面包被的第一抗体(捕获抗体)和酶标的第二抗体(检测抗体)之间,第二抗体比较容易买到,但可能会发生第二抗体的交叉反应。
任何ELISA测定蛋白质浓度的一个重要环节都是蛋白质标准曲线,通常是连续稀释已知浓度的蛋白质,从而绘制标准曲线。
2 WB
WB只能半定量。通过凝胶电泳把原始或变性的蛋白质分开,把蛋白质转膜(硝酸纤维素或PVDF),然后使用特定的酶标抗体检测。最后,加入适当的底物(化学发光底物)产生可检测的信号。虽然WB比ELISA更费时,但是WB不仅可以对特定的蛋白进行定量,而且可以在实验中同时检测蛋白质修饰。
3 MS
MS是蛋白质定量的新兴方法。在蛋白质组学分析中,除了蛋白定性之外,一个重要的步骤就是对特定的蛋白进行定量分析。MS定量蛋白的方法有很多。
使用质谱这种通用方法可以在一次实验中同时进行定量和定性检测。但这种方法需要的检测仪器很昂贵,从而限制了该方法的使用。
总之,虽然测定蛋白质含量的方法很多,但还没有一个完美的方法。在选择测定方法时,可根据实验要求和实验室条件决定。
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