ELISA是生物实验室常用的检测手段，目前已有成熟的试剂盒以及网络上各种相关试剂的配方。

（先说些废话）TMB显色液是关系到ELISA实验结果和灵敏度的重要试剂，商品化的TMB显色液现多为单组分试剂、其灵敏度高保质期长，但价格较贵且配方保密。按照网络“流传”的TMB显色液配方自行配制显色液是一个便宜大碗的选择，但如此多的配方应该如何选择？是否都可以正常显色？我尝试了三四种网络上无来源的配方，踩了一些坑，书此文以便自配显色液的朋友不要踩相同的坑。

先附上推荐配方（亲测可显色且平行性合格），想继续了解的朋友可以继续往下看

要判断哪些配方不好用，首先需要大致了解一下TMB的显色原理

TMB与H2O2等在生理pH下，由过氧化物酶催化发生第一步反应，TMB氨基失一个电子变为阳离子自由基，并在体系中以二聚电荷转移复合体(dimer charge-transfer complex)的形式存在，该二聚体在370nm和652nm有最大吸收，呈蓝色；

在低pH下复合体会再次失去一个电子，并形成稳定的醌式共轭单体结构，在450nm处有最大吸收波长，呈黄色；

如图^[1][2]

Zhang X et. Rationale of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine as the Chromogenic Substrate in Colorimetric Analysis. Anal Chem. 2020 Sep 15;92(18):12400-12406

接下来，对网络上的TMB显色液配方做一个简单的分类

1）柠檬酸、磷酸氢二钠等组成的弱酸性缓冲液 + 溶解在DMSO中的TMB，仅单组分

2）过氧化氢(或过氧化脲等)+柠檬酸盐醋酸盐等组成的缓冲液=A液，TMB+柠檬酸等组成的缓冲液=B液，双组分，使用前1：1混合

由显色原理可知，只有TMB而没有其它反应物的单组分配方可以不考虑，反应物都没有，不会显色的。市售成品单组份显色液配方不明，但肯定是有添加其它反应物和稳定剂或阻断剂的。

同理，我们应选择双组分显色液配方进行自制，但双组分配方也“琳瑯满目”，具体总结下来有以下几点不同

①缓冲液组分②TMB的储液溶剂③TMB、过氧化物用量④其它添加剂如甘油、EDTA-2Na

根据刘凤银等^{[3]的研究可以简单对配方进行判断，下面先说判断标准，再给出该研究的结论：}

①缓冲液pH在5左右

②配方中应当有甘油,EDTA-2Na

③使用DMSO溶解TMB再进行分散

④过氧化物和TMB摩尔比1：2^[2]

缓冲液pH在5附近反应效果最佳TMB浓度不宜过高，控制在0.02%(w/v)为宜最终显色液DMSO控制在2%(v/v)为宜甘油稳定TMB的保存，控制在0.5%(v/v)为宜

如有错误，请各路大佬指正赐教！

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参考

1. ^Zhang X, Yang Q, Lang Y, Jiang X, Wu P. Rationale of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine as the Chromogenic Substrate in Colorimetric Analysis. Anal Chem. 2020;92(18):12400-12406. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32794705/
2. ^^{abJosephy PD. Oxidative activation of benzidine and its derivatives by peroxidases. Environ Health Perspect. 1985;64:171-178. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3007087/}
3. ^刘凤银,卢嘉辉,巫嘉琦,黄燕璇,邹红丽,梁岳,穆洪涛.ELISA测定中HRP/TMB显色体系的优化及稳定性研究[J].广东第二师范学院学报,2020,40(03):75-82. https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2020&filename=GJXY202003010&uniplatform=NZKPT&v=6iWUJA0sn7uAPKF-0K98L5kXJjIEL3lIvpyO8qnu8wX3gFBQzfby7QPa9pPouPkL