本文转自公众号生物医学科研之家

Gut：上皮SOX9通过促进免疫抑制肿瘤微环境驱动胃腺癌的进展和转移

背景

晚期胃腺癌 (GAC)仍然是全球主要的健康负担。转移的常见部位是腹膜腔 (腹膜癌 (PC))，这代表了晚期GAC患者较高的未满足需求。治疗在很大程度上是无效的，尽管GAC治疗领域取得了一定进展，但针对该组患者仍缺乏有效的靶向和免疫治疗。SOX9是一种重要的干细胞转录因子，可以通过HMG结构域与DNA结合，介导肿瘤细胞的可塑性，并在肿瘤微环境中开始作为免疫介质融合 (TME)。然而，SOX9在影响转移性GAC中T细胞和/或巨噬细胞功能方面的作用尚不清楚。

简介

2022年8月24日，来自美国德克萨斯大学安德森癌症中心的Shumei Song 及其团队在Gut (IF: 19.819)杂志上发表名为Epithelial SOX9 drives progression and metastases of gastric adenocarcinoma by promoting immunosuppressive tumour microenvironment的研究[1]。

研究亮点

1、在本研究中，我们使用了大量RNA-seq和scRNA-seq、系列功能研究、患者衍生的细胞和小鼠模型，我们发现SOX9是在原发性GAC组织和PC肿瘤细胞中高度上调的顶级SOX蛋白之一，它与预后不良显著相关，并且介导癌症干性属性和转移。最重要的是，我们发现肿瘤细胞中SOX9的耗竭持续增强了CD8+ T细胞的应答，并部分通过旁分泌LIF因子 (一种在恶性腹水中高度富集的分泌因子)减少了M2巨噬细胞的CCL2和IL10，从而缩短了生存期。联合抑制LIF/LIFR和CSF1R M2巨噬细胞可显著抑制Sox 9高肿瘤生长和增强T细胞应答，并降低肿瘤相关巨噬细胞诱导的CCL2和IL-10细胞因子水平。因此，我们的工作表明上皮肿瘤细胞中的SOX9介导了PC TME中的先天性和T细胞免疫抑制，并指出一种通过协同靶向GAC患者PC中的SOX9/LIF轴和M2巨噬细胞的新治疗策略。

2、我们的研究结果表明，协同靶向SOX9/LIF轴和CSF1R在靶向SOX9介导的癌干细胞、T细胞免疫抑制和转移方面具有巨大潜力。前瞻性临床试验对于确定这些策略使患有PC的GAC患者受益至关重要。

主要结果

核SOX9仅在原发性和转移性GAC的上皮肿瘤细胞中表达，并与预后不良有关

为了探索PC中与GAC相关的SOX转录物的重要性，我们对来自 20 名 GAC 患者的 PC 细胞进行了单细胞转录组测序 (scRNA-seq)，并分析了所有细胞类型中的SOX转录物。均匀流形近似和投影 (UMAP)图显示，根据细胞类型生物标志物，PC细胞按T细胞、NK细胞、B细胞、髓样细胞、癌相关成纤维细胞 (CAF)和13个GAC细胞簇分组 (图1A)。SOX9和SOX2在肿瘤细胞簇中富集，但在T细胞、NK细胞、B细胞、骨髓和成纤维细胞簇中较少 (图1B)，SOX9和SOX2的表达均与短期存活者显著相关 (图1C)，而其他SOX转录物在肿瘤簇中的表达较低 (图1B)。尽管 SOX2 是涉及各种肿瘤的最彻底研究的转录因子，但我们和其他人已经确定 SOX9 作为 Notch、Hippo/YAP1 和 Wnt 胚胎信号传导的下游靶点，并且在胃癌干性维持和肿瘤进展中起重要作用。在TCGA STAD和GTEX队列中，我们注意到肿瘤组织中SOX9而非SOX2的表达显著高于正常组织或邻近正常的肿瘤 (图1D)。在包含875名患者的GAC队列KM绘图仪数据库中，SOX9高表达与生存期缩短相关 (图1E)。此外，根据TCGA STAD队列，SOX9是SOX家族中改变最多的基因之一，SOX9的改变与总体生存期和无病生存期缩短有关。此外，我们通过免疫组织化学 (IHC)染色原代GAC微阵列验证了SOX9在GAC队列中的表达，发现核SOX9在肠型和弥漫型GAC中的表达均高于其配对的正常组织 (图1F)，且与生存期缩短相关 (图1G)。在单因素分析中，Sox 9高表达患者的生存期短于低表达患者。在采用Cox回归方法的多变量分析中，SOX9仍然是一个重要的独立预后因素。此外，为了评估SOX9在PC中的重要性，我们使用免疫荧光 (IF)染色评估了96例患者PC细胞块中的SOX9表达，发现通过在PC标本中使SOX9与CD45免疫标记物共同存在，核SOX9表达在恶性肿瘤细胞中富集，但在CD45+免疫细胞中较少 (图1H)，高SOX9表达与PC患者生存期缩短显著相关 (图1I)。我们还注意到，在四对原发性肿瘤比较中，细胞核SOX9表达在PC标本中呈上升趋势，在PC标本生成的PDX肿瘤中也呈上升趋势。

图1. 核SOX9在原发性和转移性GACs的上皮肿瘤细胞中高度表达，与预后不良相关

肿瘤细胞中SOX9的耗竭增加了外周血单核细胞 (PBMCs)或腹水中CD45+免疫细胞的CD8+ T细胞应答

为了评估SOX9在PC肿瘤免疫抑制微环境中的潜在功能，我们首先检查了CD8+ T细胞与GAC19中几个上调的SOX基因之间的关联，发现在基于TCGA STAD分析的几乎所有免疫算法中，SOX9与CD8+ T细胞浸润呈负相关 (图3A)，在TCGA STAD，SOX9与CD3D和CD8A呈负相关 (图3B)。为了进一步验证这些发现，我们将GA0518细胞与SOX9 KO而非NC与来自GAC患者的PBMCs共培养，然后使用流式细胞术分析CD8+ T细胞应答 (图3C)。我们观察到，与NC细胞相比，当PBMCs与GA0518 SOX9 KO细胞共培养时，CD8+ T细胞应答增加。与NC细胞相比，SOX9 KO时CD8+ T细胞中的颗粒酶B (GrB)、穿孔素和IFNγ增加 (图3D)。与NC细胞相比，当PBMCs与AGS SOX9 KO细胞共培养时，还观察到CD8+ T细胞中GrB和穿孔素的产生增加。此外，与SOX9 KO GA0518细胞共培养时，CD8+细胞数量增加 (图3E)。有趣的是，在含有SOX9 KO肿瘤细胞条件培养基 (CM)的培养PBMCs中，与来自NC细胞的CM相比，CD8+ T细胞的CD8+ T细胞数量、GrB生成和穿孔素生成显著增加 (图3F，G)。此外，T细胞在腹水中耗竭；然而，与NC细胞相比，这些来自腹水的CD3+和CD8+ T细胞在与CM的SOX9 KO GA0518细胞共培养后能够被激活，这表明PBMCs或腹水中的SOX9介导的免疫抑制涉及CM中的分泌因子。为了阐明SOX9介导的T细胞免疫抑制是否与PC中的NK细胞相关，我们耗尽了NK细胞，然后使用来自GA0518 NC或SOX9 KO细胞的CM分析了PBMCs中的CD8+ T细胞应答 (缺乏CD56 NK细胞)。如图3H所示，与NC细胞相比，在用来自GA0518 SOX9 KO的CM处理的CD8+ T细胞中，SOX9在GA0518细胞中的耗竭显著增加了GrB和穿孔素的产生，表明SOX9抑制了独立于NK细胞的CD8+ T细胞功能。此外，当PBMCs与来自GA0518和AGS细胞的CM SOX9 KO克隆预培养时，T细胞对肿瘤细胞 (GA0518Luc)的细胞毒性增加 (图3I，J)，表明SOX9通过分泌因子抑制CD8+ T细胞的细胞毒性活性。这些数据明确表明，SOX9对于抑制PC中的CD8+ T细胞功能至关重要。

图3. 肿瘤细胞中SOX9的耗竭会增加PBMCs或CD45+腹水细胞的CD8+ T细胞应答

在KP-Luc2同系小鼠模型中，EC359和M2巨噬细胞使用PLX3397对LIF/LIFR的双重抑制增强了先天和T细胞应答，并发挥了更好的抗肿瘤作用

为了测试在免疫活性小鼠模型中抑制SOX9/LIF轴的抗肿瘤作用，我们应用了从GAC的遗传小鼠模型产生的小鼠KP-Luc2细胞系。首先，我们使用CRISPR/Cas9产生KP-Luc2 SOX9 KO，并与NC细胞进行比较 (图6A)。在免疫活性C57BL/6小鼠中，KP-Luc2细胞中的SOX9 KO显著减缓了肿瘤生长 (图6B)。流式细胞术分析显示，与NC对照相比，SOX9 KO肿瘤中CD8+细胞产生的IFNγ和GrB显著增加 (图6C)，通过q-PCR，SOX9 KO肿瘤中的Ifnr和GrB表达显著高于NC KP-Luc2细胞，表明KP-Luc2肿瘤中的SOX9 KO增加了体内T细胞免疫应答。

图6. 在KP-Luc2腹膜内PC模型中，SOX9/LIF和M2巨噬细胞的双重抑制增强了先天和T细胞应答，并具有更好的抗肿瘤作用

结论及展望

上皮SOX9通过旁分泌LIF因子在抑制GAC中的CD8+ T细胞应答和修饰巨噬细胞功能方面发挥关键作用。联合靶向LIF/ LIFR和CSF1R在靶向SOX9介导的癌症干细胞、T细胞免疫抑制和转移方面具有巨大潜力，提示针对晚期GAC的新型联合疗法。

原文链接

https://gut.bmj.com/content/early/2022/08/24/gutjnl-2021-326581

参考文献

1.Fan Yibo,Li Yuan,Yao Xiaodan et al. Epithelial SOX9 drives progression and metastases of gastric adenocarcinoma by promoting immunosuppressive tumour microenvironment.[J] .Gut, 2022, undefined: undefined.