体液分析的样本检测很多，包括气管冲洗液（Trachea Wash)，支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid），腹水（Peritoneal Fluid），胸水（Pleural Fluid），滑膜液（Synovial Fluid），脑脊液（Cerebrospinal Fluid），阴道分泌物（vaginal secretion）等。获取样本后，技术员一般需要立刻抹片，干燥，尽快染色，或将采取的样本放入空白管或EDTA管中。有关不同检测所需的管子请点击下文参考：

本文主要讲述了不同样本涂片的染色方法，操作，及注意事项。包括瑞氏染色法，瑞氏吉姆萨染色法，迪夫快速染色法，是实验室检测必备的基础操作技能。

样本中的血细胞需要通过染色来观察其内部结构，通过不同特征来区别不同类型的血细胞，识别其异常变化。细胞中的血红蛋白和嗜酸性颗粒为堿性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质;细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与堿性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜堿性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

国际血液学标准化委员会（ECSH）推荐罗氏（Romanowsky）染色为标准染色法，该法被广泛用于血涂片的常规显微检查。常用罗氏染色法有：

瑞氏染色法 Wright stain

吉姆萨染色法 Giemsa Stain

瑞氏吉姆萨染色法 Wright Giemsa Compound Stain

迪夫快速染色法 Diff-Quik®stain

瑞氏染料是由酸性染料伊红和堿性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝通常为氯盐，即氯化美蓝，容易氧化为次级染料，市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和美蓝混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞氏染料。

细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血涂片上，可以看到各种不同的色彩（如上《染色的方法》所述）。

瑞氏染料1g、甲醇500ml。将染料置于洁净研钵中，加少量甲醇研磨，研磨片刻使其溶解，将已溶解的上层染液吸出保存；对未溶解的染料再加入少量甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次直至染料溶完、甲醇全部用完为止。收集的染液置棕色玻璃瓶中，每天早晚各摇3min，持续一周以上，备用。

1. 将血片平置于染色架上，滴加瑞氏或瑞氏-吉姆萨复合染色液（A液），计其滴数，以盖满血膜为度，染色1min；

2. 滴加等量（有些现成的滴加量为染色液的2-3蓓）的中性蒸馏水或中性缓冲液（B液），用洗耳球轻吹使液面产生涟漪状，使混匀。静置染色3-10min（根据气温等条件灵活掌握，血涂片时间可略短，4min左右，染骨髓片时间应视细胞量多少而异）； 3. 用蒸馏水或常水从平放的载玻片的一端向另一端温和的冲洗（切勿先倾去染液再冲洗或使冲洗水流过急，否则沉淀物附于血膜上而不易除去）；晾干或用滤纸吸干后用油镜判读。

1. 染色时间须视何种标本，涂片厚度，有核细胞多少，何种细胞及室温等而定；通常染血液涂片时滴加B液后染2-4分钟，染骨髓片则应不少于8分钟；气温较低时，可适当延长染色时间。染色结果如出现嗜酸性粒细胞变堿，则考虑是否染色时间太长所致。

2.做骨髓涂片时，因为骨髓纤维蛋白含量较高，凝固较快，所以涂片过程要快。骨髓不可用草酸盐抗凝，否则会使血细胞核变形，核染色质致密，胞浆空泡形成，出现草酸盐结晶。

3.染液量需充足，勿使染液蒸发干燥，以防染料沉着于涂片上。

4.做细胞染色时，当天气寒冷或湿度较大时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小或在染色时脱片。

5.染料放置时间越长，染色效果越好。

6. 本试剂应由专业人员使用。

吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。

取瑞氏染料1g、吉姆萨复合染粉0.3g，甲醇500ml。具体操作同瑞氏染液配置。

PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均为不同的蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红;在偏堿性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用载玻片必须清洁，无酸堿污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏堿，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。

Diff-Quik 染色是在 Wright 染色基础上改良而来的一种快速染色方法，是细胞学检查中常用的染色方法之一,染液是采用世界卫生组织(WHO)推荐的快速染色方法而配制，与 Wright Stain类似都是利用 Romanowsky Stain 技术原理改良而来的，染色结果与瑞氏染色液也极其相似，但迪夫快速染色所需的时间极短，一般 90s 以内即可完成染色。

迪夫快速染色液含固定液，主要用于血细胞涂片、骨髓涂片、阴道分泌物涂片、脱落细胞涂片等染色，非常适合用于批量浸染，且背景清晰无沉渣。

1. 常规方法制备血液涂片或骨髓涂片，自然干燥或酒精灯火焰干燥后，Diff-Quik Fixative 固定 20s。注意：根据待检样本的不同，采用的固定策略也不同，具体请参照注意事项 3、4、5。

2. Diff-Quik Ⅰ染色 5～10s。

3. Diff-Quik Ⅱ染色 10～20s。

4. 水洗后立即趁湿在显微镜下观察。

5. 将观察后认为有价值的片子带回实验室，用二甲苯透明，封固、保存。

1. 血液涂片或骨髓涂片应厚薄均匀，以免影响染色效果。

2. 血细胞涂片染色要求新鲜全血或 EDTA 抗凝血。血膜未干透，细胞有可能尚未牢固附在玻片上， 在染色过程中容易脱落，因此血膜必需充分干燥。

3. 骨髓涂片染色要求制备好的涂片在空气中快速摇动或扇干，以防止细胞皱缩变形或因空气潮湿而溶血，不能用高温或火烤来干燥涂片。

4. 阴道分泌物涂片染色要求新鲜标本涂片后，尽快以火焰或酒精固定，以免细胞变形。

参考：《宠医客》

参考资料：

1. Daniela Hernandez Muguiro;Sampling and Smear Preparation; Equine Cytology, 2022(3).

2. 范开,董军.宠物临床显微检验及图谱[M].北京:化学工业出版社,2006:5.

3. 瑞氏染色原理及方法;医学教育网，2018:8.

4. 血涂片染色及常见问题排查;宠医客,2022（2）.

5. 吉姆萨与瑞氏染色原理;微生物检测方法和标准;海博生物，2011（4）.

6. 迪夫快速染色液（DIFF-Quik Stain）；南京森贝伽生物科技有限公司.