“核酸提取仪”的诞生和发展

新型冠状病毒的检测需要经过取样、留样、保存、核酸提取、上机检测五个步骤，大多数临床样本中的核酸浓度相对较低，从复杂的生物样品中提取高纯度的核酸对保证高灵敏度和高准确性的核酸检测起著关键性作用。

核酸提取是指从复杂体系中实现核酸的分离和纯化，核酸分子一级结构的完整性、纯度、样品溶解率与核酸吸附率等均可作为核酸提取效率的指标。

1869年，瑞士医生和生物学家Friedrich Miescherf通过分离获得核酸，叫做Nuclein；

19世纪80年代初，德国生物化学学家Aibrecht Kossel进一步纯化获得核酸；

1889年，核酸这一术语由德国病理学家Richard Altmann创建；

1938年，第一个DNA的X射线衍射图谱被英国物理学家和生物学家William Astbury和Florence Bell（后来改名为Florence Sawyer）发表了；

1953年，DNA的结构被美国分子生物学家James Watson和英国分子生物学家Francis Crick确定了；

此后，研究者在提取材料和方法上不断进行改进,发展出一系列核酸提取技术。其发展历程如下：

“核酸提取仪”的原理

核酸提取仪的工作原理

目前，核酸提取仪的工作原理主要分为磁珠法和柱提法，其中磁珠法在当前市场占主流地位。

磁珠法的工作原理主要利用磁珠对核酸的特异性识别和高效结合性，通过磁珠吸附核酸达到分离效果，常见的磁珠种类包括氧化锆磁珠和二氧化矽磁珠等。根据磁珠与液体的分离方式又细化分磁棒法和抽吸法，二者原理和过程相同。

磁珠法提取过程示意图

磁珠法核酸提取仪的特点

1.高效简捷，能够实现高通量操作，操作简单，用时短

2.灵活稳定，能够实现自动化操作，重复性高

3.安全环保，减少对操作员身体的危害

4.价格低廉，可满足数据库建设

5.质量稳定，核酸纯度高

柱提法的工作原理主要利用二氧化矽对核酸特异吸附性，在高盐，低pH的环境下将核酸吸附在矽胶膜上，后经离心或洗脱（洗脱液为低盐高pH溶液）等方法将其剥离，达到分离的目的。通量一般在1-12个样本，操作时间与人工提取相比较，没有显著优势，因此目前主要应用于实验室研究中使用。

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柱提法提取过程示意图（图源网络）

“核酸提取仪”的分类

根据仪器型号大小不同划分

1) 自动液体工作站

自动液体工作站是功能非常强大的设备，液体分液、吸液等自动完成，甚至能通过整合扩增、检测等功能，实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用，不太适合常规实验室提取核酸，一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大(至少96个，一般几百个)的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作，需要比较大的资金。

2) 小型自动核酸提取仪

小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊性来达到自动提取核酸的目的，可以在任何实验室得到应用。

根据提取原理不同划分

1) 采用离心柱法的仪器

离心柱法核酸提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法，通量一般在1-12个样本，操作时间和手工提取差不多，并不能提高实际工作效率，且价格昂贵，不同型号仪器的耗材也不能通用，仅适合经费充足的大型实验室使用。

2) 采用磁珠法的仪器

以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低PH值下吸附核酸，在低盐高PH值下与核酸分离的原理，再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程。由于其原理的独特性，所以可设计成很多种通量，既可以单管提取，也可以提取8-96个样本，且其操作简单快捷，提取96个样本仅需30-45min，大大提高了实验效率，且成本低廉，因而可以在不同实验室使用，是目前市场上的主流仪器。

根据工作性质划分

1) 手动核酸提取，存在操作步骤复杂、效率低，核酸纯度低等问题。

2) 全自动核酸提取，是应用配套的核酸提取试剂来自动化完成样本核酸的快速提取，具有操作简单、精确性高和稳定性强等优势。在本次新冠疫情中，高通量全自动核酸提取仪在大规模人群核酸检测中发挥了重要作用。

“核酸提取仪”的应用

核酸提取仪在与生物分子相关的分离纯化工作的实验室中，都是十分重要的一类仪器，可广泛应用于基因组学、疾控医疗、临床诊断、法医鉴定等领域。

1.基因组学

无论提取样本的来源是微生物、动物、植物或是病毒，核酸提取仪结合配套的试剂盒，可以快速的纯化出足够数量和纯度的DNA或RNA。高质量的核酸可以满足下游各种应用(如PCR/Real-time PCR、基因芯片、Southern blot、Northern blot)的需要。

2.CDC疾病预防控制

基于全自动核酸提取仪的快速和高通量技术，可用于解决甲型H1N1流感病毒（Influenza A virus subtype H1N1）、儿童手足口病、麻疹病毒等的快速自动化疫病监测系统，提高重大疫情应对响应能力。

3.临床样品的分子诊断

核酸提取纯化系统可快速高通量的处理临床样品，提取的核酸可用于后续的分子诊断，且同样适合于福尔马林固定石蜡包埋(formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE)的组织样品。

4.畜牧兽医

可高效、高灵敏度地提取禽流感病毒(avian influenza virus)、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、猪瘟病毒（Classical swine fever virus,cSFV）、牛病毒性泻病毒(Bovine viral diarrhea virus)、立克次体(Coxiella burnetii)等。

5.法医学的应用对于法医工作而言，核酸提取的效率和稳定性都是十分重要的。核酸提取仪与专门的法医样品核酸提取磁珠试剂配合使用，可从包括烟蒂、毛根、软骨、指甲、血痕等不同来源的材料中纯化高质量的DNA。

山东博科–全自动核酸提取仪

“核酸提取仪”常见问题及解决

1. 磁棒式核酸提取仪手工提取与上机提取结果存在显著差异

磁棒式核酸提取仪通常采用磁保护套（搅拌套）来转移磁珠、混匀液体，深孔板底部采用加热模块加热深孔板孔内的液体，从而模拟手工操作的流程。手工提取的实验结果只能说明手工操作流程及试剂质晕没有问题，转移到仪器上后，要综合考虑。

磁珠法通用的操作流程：裂解、结合、洗涤、洗脱，在手工操作时都可以分步骤实现，而在上机操作时考虑到最大限度避免人工操作，通常会把裂解与结合放在一个孔位内进行，客户一般会采用醇类作为结合液，这样操作不但稀释了裂解液，还影响裂解效率，而且由于孔位内液体温度不断升高，导致醇类挥发影响结合效率。此外，仪器一般采用底部加热模式，孔位内的温度不能以仪器设置温度为标准，不同厂家的仪器之间加热效率也会有所不同，所以单说裂解这一步就需要对上机的体系进行一些优化。

2.磁棒式核酸提取仪孔位之间提取效率有所差异

磁棒式核酸提取仪通常采用卡片或弹黄钢珠固定96孔深孔板，底部有凹槽形的加热条，在进行有加热条件的实验时，如果深孔板的孔位与底部加热凹槽贴合的不紧密，会直接影响实验结果，这种悄况导致孔位间的实验结果不稳定是随机出现的。如果发现某一固定孔位的提取结果总是与其他孔位相差比较大，可以考虑仪器加热模块是否有问题，同时观察该孔位的上游裂解孔位内是否有磁珠残留，可用空白样本检测仪器在孔位间的转移磁珠能力是否彻底。

3.磁棒式核酸提取仪上机提取时加入的洗脱液体积与实际得到的核酸溶液体积存在差异

目前市场大多数的磁棒式核酸提取仪的加热模块位于96孔深孔板的第一、六、七、十二列，第一、第七列绝大多数作为裂解结合孔位使用，而第六、第十二列作为洗脱孔位使用，由于大多数的提取实验在裂解结合步骤需要加热、而第六列与第七列相邻，由于热传导效应的存在，使得裂解加热时同样也会导致位于第六列内的洗脱液温度升高，从而导致洗脱液蒸发，由于洗脱液的体积较小（50μL-200μL)，使得实际得到的核酸溶液体积相比于加入的洗脱液体系有较大差异。

4.提取的核酸得率低的问题

a.样品量与试剂的配比要控制在一定范围，避免超过裂解能力。

b.破碎研磨的步骤处理细节很重要，一定要充分研磨，这是核酸提取的条件。

c.在洗脱的步骤，使用足量的洗脱液洗脱并充分混匀，避免有团块wjdtpod残存。

d.实验耗材要匹配，如不同的吸附柱或磁珠的核酸吸附能力不同，也会影响核酸的得率。

5. 提取核酸出现降解的问题

a.提取的样品量要符合试剂的配比，尽量控制样品量达到合适比例。

b.每个步骤都要注意充分的混合均匀，避免团块的残留影响实验结果。

c.在洗脱时，时间过长或者温度过高，核酸有可能会降解。

d.样本切记不可反复冻融，提取的样本要注意在合适的温度保存，长期保存尽量-80℃。

6. 提取到的核酸纯度不够高的问题

a.样本量和裂解液等试剂的配比要尽量控制到合适的范围。

b.混合均匀以确保裂解充分和没有团块残留。

c.晾干的步骤要充分，否则可能会导致醇类等杂质的残留。

d.磁棒振荡幅度太小或混合时间太短，磁珠上有杂质残留会影响磁珠吸附核酸的能力。

“磁珠核酸提取仪”的常见误区

误区一：磁珠使用的越多，提取效果越好

有很多老师喜欢在提取效果不佳的时候，增加磁珠的用量，认为磁珠多加一点，就能吸上更多的核酸，不得不说这种想法是不可取的。

磁珠的主要特点是既可以分散于液体中，也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离，任何试剂体系，磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的，超过一定的比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中，而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质，对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候，过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分，导致整个试剂盒效率低下。有很多时候，在提取效果不佳的时候，减少磁珠使用量，反而是提升提取效果的最优途径。

通常情况下，磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的，因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多，但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好，是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。

以GNT-02系列磁珠为例，在提取常量样本（植物组织，全血等）时，通常用量为10ul/次；在提取微量样本（如血清游离DNA，口腔拭子等）时，磁珠用量为15~20ul/次。如需超过这个使用量，需要和技术工程师进行沟通。

误区二：试剂使用的越多，提取效果越好

裂解效果不好？多加点裂解液。洗涤效果不好？多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。

但是对于磁珠法而言，每增加一部分液体体积，就减少了更多的磁珠碰撞几率，而降低磁珠碰撞几率，会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候，虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的，所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。

对于GNT-B02全血基因组DNA试剂盒而言，一般裂解液使用量不应超过400ul/次，洗涤液使用量不应超过500ul/次。如果确实需要放大体系，磁珠和样本用量也应该相应增加，这种放大不一定是等比例的。

误区三：洗涤次数越多，提取效果越好

提取得到的核酸杂质过多时，使用者会考虑多进行几次洗涤，以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸，但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸，且增加了核酸断裂水解的可能性，所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。

GNT系列的试剂盒，单一纯化类试剂盒的洗涤次数为2次，植物、动物类试剂盒的洗涤次数为3次，血液类试剂盒洗涤次数为3~4次。

误区四：样本取用的越多，提取效果越好

在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下，往往核酸提取效果不好，很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。

但简单地增加样本取样量，有时会引入过多的杂质，超出裂解液裂解能力，也会使提取效率降低，所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。

如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低，建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性，使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。

误区五：某一种磁珠好，就应该在所有试验中效果都好

磁珠的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导致磁珠特性千差万别。

所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂，配方也并不完全相同，同样应用于核酸提取的磁珠，性质也并非完全一致。

有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏堿性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪；有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。

很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况，除了固定的试剂盒配合，多数情况下，磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。

误区六：和某种试剂盒对比效果不好，就是磁珠不好

很多客户在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下，简单地等量替换磁珠，用于比较磁珠效果。

这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论，但实际上，由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的，往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。

“核酸提取仪”的选购

核酸提取仪的常见核心参数有：抽提原理、机械原理、抽提时间、样品处理量、样品管容量、Tip头处理量、Tip头数量、接口、仪器重量、仪器尺寸等。同时，在采购核酸提取仪时，除关注上述核心参数外，还需考虑以下因素：

1. 操作简单、上手好用

每次提取工作，操作者只需要做好安装工作，布置好孔板（提供提取所需要的试剂）。提取整个过程都不需要人为的帮助，仪器自动完成，尽量配置中文界面，有利于学习仪器使用和编辑程序，减少新操作人员的错误操作，降低实验失败风险。

2. 高通量、快速、便捷

针对于不同应用场景，能够一次性实现对尽可能多的样本的快速处理，可在短时间完成提取工作，确保核酸提取的高效、快速、及时。

3. 安全环保、稳定无污染

操作过程中涉及到的试剂盒及溶剂等，应尽可能的低度、且对人体无害。

4. 成本低、平台开放

基于成本考虑，在采购时，还应考虑试剂耗材的消耗及供应周期，可尽量选择适配不同规格耗材和不同厂家提取试剂，且兼容性高的仪器。

“核酸提取仪”的使用和注意事项

以某品牌的核酸提取仪为例

一. 仪器的开箱和安装

1. 打开仪器包装

为了减少人为对仪器造成的损坏，请按如下方式打开包装。

剪断绑在仪器包装箱外的打包带，打开包装箱；

取下附件包装袋；

紧紧地抓住塑料泡沫，小心地将仪器连同塑料泡沫一起从包装箱中取出；

移除仪器外部的塑料泡沫和塑料袋；

抓住仪器底部，将其可靠地放置在实验台上。

打开门，取下蝶形螺钉和固定块，否则会损坏仪器。

注意:任何时候都禁止用手柄移动仪器。

2. 开箱检验

打开核酸提取仪包装后，用户需要检查收到的零件是否与装箱单相符。

3. 仪器安装

3.1. 仪器的放置

本仪器应放置在室内，通风良好，无腐蚀性气体或强磁场干扰。不要将仪器放在潮湿或多尘的地方。

该仪器上的开口是为通风而设计的。为了避免过热，不得堵塞或覆蓋这些通风孔。温度过高会影响仪器的性能或导致故障。请勿在阳光直射下使用本仪器，并远离暖气、火炉和所有其他热源。

长时间不使用仪器时，拔掉电源插头，用软布或塑料盖住仪器，防止灰尘进入。

3.2. 电源线的连接

a)注意电源的使用。

连接交流电源前，确保电源电压与仪器要求的电压一致(允许有10%的偏差)，并确保电源插座的额定负载小于仪器的要求。

b)注意电源线。

本仪器通常应使用随附的电源线。如果电源线损坏，必须更换而不是修理。必须换成同型号同规格的电源线。使用本仪器时，不要按压电源线上的任何东西。不要将电源线放在有人行走的地方。

c)插入并拔出电源线。

插拔电源线时，请务必握住插头。插入时确保插头完全插入插座，拔出时不要拔出电源线。

3.3. 安装紫外线杀菌灯

用户必须按照以下步骤自行安装紫外线杀菌灯(与荧光灯的安装方法一致):

a)将紫外灯管的插头从灯座的凹槽中推入灯座中；

b)旋转90度。

4.工作环境要求

考虑到仪器的安全性和性能，安装核酸提取仪的环境应满足以下条件:

非爆炸性环境；

正常大气压(海拔应低于3000m)，环境温度20o-35℃，典型使用温度25℃；；

相对湿度从10%到80%；

流动的空气应在35℃或以下；

避免过热和液体意外溅到仪器中(不要将仪器放置在热源附近，如电加热器，为防止电子元件短路，避免水或其他液体溅到仪器中)。

5. 空气供应要求

核酸提取仪在35℃以下，需要充足的空气供应来驱散仪器中的热量。进气口和出气口位于仪器的背面。如果供气不足或空气温度过高，会导致仪器故障，甚至自动死机。

请确保充足的空气供应:

不要挡住进风口，核酸提取仪离其他垂直表面至少10cm，离其他热循环仪或发热仪器更远；

不要让灰尘或纤维聚集在进气口。

请确保空气足够凉爽。

不要在前面或后面放置两个或两个以上的核酸提取仪(或其他仪器)，以免排气口的热空气直接进入进气口。

测量仪器入口处的空气温度，确保进入仪器的空气温度为35°C或更低。

6. 保护接地

a)仪器接地

为避免触电，仪器的输入电源线必须可靠接地。本仪器使用三芯接地插座，有第三(接地)针，只能与接地电源插座配合使用。这是一个安全装置。

如果插座无法插入插座，请请电工安装正确的插座，以免使接地插头失去安全功能。

b)远离带电电路。

操作人员不允许擅自打开仪器。部件的更换或机器内部的调整必须由经过认证的专业维护人员完成。请勿在连接电源的情况下更换组件。

注意:仪器三相电源输入端的接地端必须可靠接地。

二. 操作保护和限制措施

1. 操作前的保护

请完整阅读本手册，其中包含全面操作本仪器的必要信息。

安装:该仪器应按照第1部分的要求打开包装并安装。核酸提取仪三相电源输入，接地

终端必须可靠地接地。

2. 运行中的保护

机器运行过程中禁止打开核酸提取仪的门，否则会对仪器造成永久性损坏；

操作时，样品室的加热器表面温度较高，禁止触摸；

每当打开机壳时，必须切断电源。

3. 确保风道畅通。

当仪器被空气加热和冷却时，必须保证空气入口和出口畅通无阻。如果有灰尘，可以使用软刷和湿布。

或者真空吸尘器。如果这些孔被灰尘或纤维堵塞，机器将有加热和排气障碍，从而导致

相关性能故障。

警告:为防止风道堵塞，请经常检查进气口和出气口的灰尘积聚情况。

4. 危险因素

4.1 样品污染

由于本仪器多用于检测污染样品，因此必须放置在PCR laboratory中，操作人员在操作时必须遵守PCR laboratory的相关规定，穿戴防护服、防护手套等相关防护措施。

4.2 电源

确保使用核酸提取仪随附的电源线；只有主电源插头才能插入带接地保护的电源插座。没有保护地线就不能用延长线；

在切断主电源之前，请不要更换保险丝；

确保只使用实验所需的电流和特定类型的保险丝，禁止使用替代保险丝和短路保险丝盒；

仪器通电时，打开外壳或拆卸零件会造成人身伤害，因此在进行任何调整、更换、维护或修理前，请切断所有电源；

4.3 缺陷和异常情况

当保护措施可能已经损坏时，停止使用仪器，并确保没有无意识的操作。如果仪器出现以下情况，保护设施可能已经损坏:

可见损坏；

无法开展预期工作；

运输压力太重，承载压力太重；

在不合适的条件下储存时间过长。

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