什么朋友问我，限制性核酸内切酶究竟是做什么用的，它的原理是什么，回想起我在接触这个概念的时候还是在高中生物，当时老师跟我讲的时候告诉我们它就像一个基因剪刀一样，可以将我们细胞内的DNA切断，但是至于究竟怎么切割的的，对我们的生物学领域可以有哪些应用这些知识还是没有涉猎到，所以今天这第一讲就要从限制性核酸内切酶讲起。

什么是限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）

• 限制性内切酶在上个世纪50年代初被发现，并迅速成为DNA分子生物学的关键参与者。40年前，那些开拓性的研究了这些酶的活性和序列特异性的科学家们获得了诺贝尔奖，他们的研究为确定这些酶作为DNA表征、作图和操作工具的巨大潜力做出了贡献。因为这些酶已经伴随着DNA的历史超过50年，代表性地见证了这一领域的主要步骤。
• 早在20世纪50年代，Luria SE and Human 发现了细菌具有抵抗噬菌体感染的能力，他们还观察了噬菌体感染细胞的整个过程中，感染能力是逐渐递减的，这说明噬菌体不是一开始就丧失了感染细胞的能力，而细胞也不是一开始就具有抵抗噬菌体的能力。随后，他们确定了细胞之所以会产生潜在的防御系统，是基于细胞体内的一种具有酶，这种酶可以特异性的切割噬菌体的DNA序列，可以通过消化噬菌体DNA来限制病毒作用因此称为限制性核酸内切酶（之前有小伙伴不知道“限制”两个字的含义，这回明白了吧！以下简称限制酶）。限制酶在特定DNA序列所代表的位点上能够结合DNA并切割对称和特定的核苷酸序列，限制酶的表征发展非常迅速，目前发现的限制酶大致分为4类。其中我们最常用的是II型限制酶，通常用来识别DNA它们只需要镁离子而不需要ATP，识别他们的目标DNA序列并将其切割，源自多种细菌的许多限制酶均属于此类，已鉴定出数百种识别/切割序列。使用限制酶的不同组合，就可以对DNA进行多种操作。
• I，III和IV型限制性内切酶由于其DNA切割特异性较低而在DNA研究中使用较少，它们的切割位点通常与目标定位序列相距很远，通俗的说，他们不能很好地按照我们人类的旨意发挥作用，所以我们不经常用他们！

限制酶切割DNA双链模型图

限制酶的基本用途：

1. 物理DNA定位

刚开始的时候，人们并不能很好的利用限制酶进行特定切割，指哪打哪的那种，但是人们可以利用“一堆限制酶”对DNA进行切割，可想而知，DNA就会断成“很多节”，而这样的很多节的DNA就构成了一个图谱（限制谱），人们可以在利用这个限制谱做一些事情，比如比较属于不同来源的物种他们的限制谱差别，鉴定两个样本是否属于同一物种等等。但是由于II限制酶具有高度的特异性，当DNA序列中一个核苷酸位点发生变化，也可能导致限制酶无法进行切割，这就使得在绘制限制谱的时候收到了阻碍，为解决这一问题，科学家在1976年引入免疫印迹实验法，通过琼脂糖凝胶将切割的DNA片段按片段大小进行分离，这样我们可以根据片段大小找到我们感兴趣的DNA片段，将他们所在的那部分凝胶切下来后将DNA转移到纤维素滤膜上，然后将滤膜与放射性标记的特异性DNA探针进行分子杂交，这样我们就可以对我们感兴趣的那段DNA片段进行研究了。另一个限制谱的应用就是分析DNA片段长度的多样性，通过比较不同样本切割下来的DNA片段长度，我们就可以比较这些样本是否是来自同一物种啦。

2. 对DNA进行操作

学过生物的小伙伴们肯定对“基因重组”这个词不陌生吧，它可是对分子生物学以及生物医学和生物技术产生了革命性的影响！Lederberg（1952）在鉴定出第一种限制性酶之前不久，提出将“质粒（Plasmid）”一词用于形容除决定遗传或性别的染色体外的所有DNA元素。几年后（Hickson et al.1967)，对质粒DNA的物理和化学特性及其环状性质进行了表征的验证，并通过电子显微镜技术观察到了质粒。 1972年，科恩（Cohen）和同事们将外源的闭环DNA序列导入细菌菌株中，该序列中含有对特定抗生素的抗性基因，他们通过筛选在相同抗生素存在下的生长能力来选择含质粒的种群（Cohen等，1972）。与此同时，人们成功在大肠杆菌提取物中发现了能够连接聚脱氧核苷酸链并将氢键结合的DNA连接酶，DNA连接酶具有通过创建新的磷酸二酯键连接互补模板上两个相邻核苷酸的能力。 但是，在1970年代初，仍然缺少用于DNA特异性片段化的工具。可以说，万事具备，只欠东风（“剪刀”）了。

为解决这一剪刀问题，以前人们还尝试过用机械方法“震碎”DNA，但是效果非常不理想，不是震的不够彻底，就是震的太碎导致DNA损伤，知道限制酶的发现，彻底解决了这一”东风“。人们还验证，限制酶剪切过得DNA，可以将双链的DNA切得两边不一样长，出现一个交错的切口，留下了一个可以互补配对的粘性末端，以为为后续桥接做准备。到这里”基因重组“的游乐场就已经准备好了，接下来人们就陆陆续续将它玩出各种各样的花样来！

通过连接来自不同生物体的DNA片段，可以生成所谓的嵌合DNA。 第一个实例是将一些DNA片段插入pSC101质粒。 这些实验证明，可以使用细菌质粒从各种来源克隆DNA， 在用产生相同类型末端的限制性内切酶切割DNA后，可以制作出来自不同生物体的DNA的连接； 最后但重要的一点是，该重组不会影响质粒本身的功能，而质粒本身会继续复制和转录所携带的基因。

今天先写到这里，希望对想要了解限制酶的小伙伴们有所帮助，接下来会陆续更新。