追溯液相色譜的發展歷史，最早最經典的液相色譜實驗當屬俄國植物學傢茨維特的葉綠色提取實驗：將植物色素提取液從一根裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管頂端加入，然後用純石油醚進行淋洗，隨著石油醚往下流動，不同色素逐漸分開形成色帶。液相色譜技術發展到今天，商業化的色譜儀已廣泛用於分析混合物，但無論儀器設備如何發展，現代色譜儀的組成仍源於茨維特實驗。液相色譜儀主要包括儲液瓶、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據處理系統(圖1)本專題將按色譜儀的基本組成，簡要介紹各部分的工作原理及註意事項。

圖1. 液相色譜結構圖

1. 儲液瓶

儲液瓶用於盛放流動相（圖2），規格有25 ml、500 ml、1000 ml、2000 ml甚至更大。儲液瓶通常為高硼矽玻璃材質，也有特殊情況，比如離子色譜使用聚氯乙烯儲液瓶以避免引入金屬離子幹擾。存儲特殊的流動相時，儲液瓶的顏色也會不同。比如水相，常用棕色瓶進行避光，以降低細菌生長速度。

開孔儲液瓶瓶蓋是與儲液瓶配套使用的，流動相傳輸管穿過瓶蓋上的孔插入儲液瓶內。瓶蓋主要包括三部分：聚丙烯外殼、矽膠防漏墊圈和四氟乙烯白色內蓋，該類材質需具有良好的抗腐蝕、耐高溫性能。瓶蓋有單孔、雙孔、三孔等規格，用於插入不同數目的管路（圖2b），管路與孔之間存在一定間隙或有多餘的孔用於排氣，以防止瓶內負壓過低，導致流動相不能順暢輸出到泵體。

8f7c7be8c611e8c7ec34d421790eacbb圖2. 流動相儲液瓶

潔凈度是儲液瓶最基本也是最重要的標準。不幹凈的儲液瓶會引入雜質，幹擾分析結果，甚至將導致後續流動相管路堵塞，誘導泵體故障。因此，儲液瓶需要定期按標準玻璃器皿清洗流程進行清洗，以確保流動相質量。主要過程如下：（1）浸酸：將儲液瓶浸泡於重鉻酸鉀、濃硫酸、蒸餾水的清潔液中，時間不少於4小時。清潔液具有很強的氧化作用、去污能力強，能有效去除微生物和微量雜質；（2）沖洗：先用自來水充分沖洗，火吸管等沖洗10分鐘，瓶內灌滿、倒掉，反復20次以上；再用去離子水沖洗，不留死角，瓶內灌滿、倒掉，反復10次以上，然後用超純水進行充分漂洗和潤洗，最後晾幹或烘幹備用。清洗液配比如下表：

表1. 不同酸度的重鉻酸鉀清洗液配比

d030f58217e25cf21d3cdfc78f1741da

註意事項：清洗液使用耐酸抗氧化性塑料容器存儲；將重鉻酸鉀倒入水中，攪拌溶解，然後緩慢加入濃硫酸，由於濃硫酸密度大，且遇水放出大量熱，操作切勿過急，嚴禁將重鉻酸鉀溶液倒入濃硫酸中。

上述清洗方法，需進行充分的沖洗和潤洗，否則可能會引入較多雜質。筆者所在的色質譜實驗室，流動相更換頻率較高，在儲液瓶中盛滿有機相和超純水的混合溶液（比如10%-20%有機相），超聲半小時再進行超純水清洗，可達到簡單清洗的目的。儲液瓶除定期清洗外，平時操作應養成良好習慣，比如：勤換水相；更換流動相，先潤洗再更新，禁止在剩餘流動相中直接添加新的流動相；瓶蓋上多餘不用的孔，可用堵頭堵緊或用鋁箔封住儲液瓶口，防止灰塵落入。但是原則上不建議使用封口膜封住儲液瓶口，因為流動相可能會溶出封口膜中的聚合物成分產生雜質。

2. 過濾沉子

過濾沉子位於流動相管路末端（圖2a），在重力作用下使流動相管路沒入儲液瓶底部。沉子是表面具有1 μm、2 μm、5 μm、10 μm、20 μm等各種孔徑規格的吸濾頭，常用規格為2 μm和10 μm，能有效防止已經進入儲液瓶內的灰塵進入後續液相系統。儲液瓶一般高於泵體50 cm以上，基於虹吸作用，流動相能快速經過沉子。市場上基本的沉子有不銹鋼、陶瓷、Peek等其他惰性材質(圖2c)。

過濾沉子也需定期進行超聲清洗。用於反相色譜的沉子，先用超純水加熱超聲15分鐘以除去沉子上的鹽分，再用HPLC級的異丙醇超聲15分鐘除去有機物，最後用HPLC級甲醇超聲15分鐘除去難溶物。用於正相色譜的沉子，超聲使用的溶劑依次為乙醇-超純水-異丙醇-乙醇，超聲時間為15分鐘左右。

3. 流動相

流動相是影響色譜分離的關鍵因素之一，高純度、無微粒的流動相是液相色譜分析最重要的標準之一。滿足這一標準，最簡單的方式是盡可能使用高質量的溶劑，高效液相色譜純（HPLC）級別是液相色譜的基本要求，對於液質聯用儀器，由於質譜具有很高的靈敏度，要求使用質譜純（LC-MS）級別的溶劑。

3.1配制 液相流動相可分有機相和水相，為保證流動相配比的準確性和質量，配制流動相時需註意以下事項：

1. 流動相配置過程中使用的量筒等玻璃器皿需預先清洗幹凈，有機相和水相使用的量筒最好分開使用；
2. 盡可能使用HPLC或LC-MS純度試劑，如加入甲酸、乙酸或氨水類添加劑，也盡量使用高純試劑，蓋上蓋子搖勻；
3. 含緩沖鹽的流動相，需準確稱量緩沖鹽，並置於容量瓶中溶解；
4. 對pH有要求的流動相，加入酸、堿進行pH值調節，並測量pH值；
5. 流動相需經過濾和脫氣處理；
6. 配制好的流動相，需註明流動相成分及配制日期。

3.2過濾 進口商業化的HPLC試劑在分瓶之前已經過濾膜過濾（一般為0.22 μm），Milli-Q 超純水在純化過程的最後一步，也會經過0.22μm濾膜。此類HPLC純度的溶劑可以直接使用，無需再進行過濾。如果在上述流動相中添加其他非HPLC級別的試劑或者緩沖鹽，使用前強烈建議過0.22 μm濾膜。

流動相過濾裝置見圖3，主要包括：濾杯，濾膜，砂芯，接收瓶，真空泵。流動相盛放於濾杯中，在真空用下，經濾膜和砂芯過濾，最後被接收瓶接收。過濾裝置使用的玻璃器皿或連接管要求為惰性材質，避免引入更多雜質。濾膜常用孔徑為0.22 μm和0.45 μm，根據流動相性質差異，濾膜又可分水相濾膜和有機相濾膜，以確保過濾過程中，濾膜成分不被流動相溶解帶入更多雜質。

79926124d9db97e8554b329989780380圖3 流動相過濾裝置圖

3.3脫氣 商業化的液相色譜儀具有在線脫氣功能，保證流動相進入泵前除去氣泡。流動相中若含有氣泡，會導致泵壓增加，流動相傳輸不暢；對於檢測器而言，氣泡的存在會產生假的色譜信號，導致基線不穩；對於電化學檢測器，氣泡中氧氣的存在，甚至導致化合物氧化、檢測結果不準。因此流動相需要進行脫氣處理。氦氣噴霧脫氣、真空脫氣和在線脫氣是常見的脫氣方式。

3.3.1氦氣脫氣 氦氣在流動相中溶解度小，可有效脫去流動相中的氣泡。具體做法為：在流動相儲液瓶中，插入一根氦氣管路，沒入流動相的一端連接過濾沉子，另一端連接低壓力的氦氣流（5 psi左右），由於氦氣難溶，在其逸出液面過程中將帶走流動相中溶解的空氣。需要提醒的是，不同體系，使用氦氣脫氣也稍有不同。反相色譜，使用該方法脫氣數分鐘可達到目標；而正相色譜，由於流動相極易揮發，需縮短脫氣時間或通過其他方式脫氣。常規的液相分析儀器，使用氦氣脫氣較少，在制備液相色譜中，由於管路粗，流動相流速大，流動相中易含有空氣，氦氣脫氣較為普遍。色質譜實驗室正反相制備色譜儀，均采用氦氣補入進行脫氣。

3.3.2真空脫氣 流動相置於真空環境10-15分鐘，可有效脫去流動相中60-70%的溶解氣體。在圖3中，流動相過濾結束，接收瓶用惰性橡皮塞封口，真空泵繼續工作數分鐘，即可實現流動相脫氣。實驗室中將整個流動相儲液瓶放在超聲波清洗儀中進行超聲，也可脫氣。

3.3.3在線脫氣 在線脫氣是最為普遍的一種脫氣方式，商業化的液相設備都裝有在線脫氣機，位於高壓混合器或者比例閥之前（圖4a）。在線脫氣機的工作原理如圖4b所示：流動相經過聚合物管路，該管路能選擇性讓氣泡通過，而流動相不通過，整個管路置於真空腔體中，由於壓力變化，溶解在流動相中的氣泡將被拉出聚合物管道。與氦氣脫氣相比，在線脫氣效率較低，但成本較低。

圖4在線脫氣機原理圖