导语

“第一次绿色革命”解决了世界粮食产量增长问题。

“第二次绿色革命”要解决世界粮食生产绿色发展的问题，其本质是“基因革命”。找到那些蕴藏在植物体内和高产、优质、美味以及与生长期和抗病抗虫、耐旱耐涝、抗倒伏等生物性状相关的绿色基因已成为研究人员的重要课题。

但于亿万个堿基对中遇到你所要找的基因，不容易！那些缠绕在蛋白质上的上亿个基因，曾像那“雾中花”、“水中月”一样难以捉摸。

今天要讨论的就是如何更高效地通过分析重组单株，精细定位基因。

01 为什么要筛选重组单株？

进行基因定位，有一个基本的原理，就是当标记与基因足够近的时候，标记与基因之间不再有重组交换发生。所以，对重组交换单株（简称重组单株）的分析，就是不断缩小基因区段，进行精细定位的过程。

02 怎样获得重组单株？

重组单株，就是利用基因区域两侧的两个标记，对分离群体的单株进行基因型分析、两个标记检测到的基因型不一样的植株，比如标记1是亲本A的基因型，标记2是亲本B的基因型，或者说一个标记是杂合基因型，另一个标记是两个亲本之一的纯合基因型。

这里要引入一个概念，图位克隆。图位克隆是指在不知道基因产物结构和功能的情况下克隆基因的一种方法，基本程序是先利用分离群体对目的基因进行初步定位；然后以基因两侧紧密连锁的分子标记筛选基因组文库（如BAC, YAC, PAC, TAC, cosmid等），进行染色体步查（Chromosome walking），构建物理图谱，即包含基因区段的阳性克隆重叠群（contig）；最后，利用重组单株进一步缩小目的区段，并通过目的区段测序、生物信息学分析、表达分析、比较测序和功能互补试验等方法来验证候选基因的功能，最终分离克隆基因。

经典的图位克隆法，先利用RFLP标记进行全基因组QTL扫描，获得包含基因的区段。如图1所示，利用一个三交分离群体02428/南京11//Balilla，广亲和基因S5位点被初步定位在Chr6的两个标记RM253与R2349之间。

图1：广亲和基因S5位点的初步定位

随后，再利用与基因紧密连锁的具有多态性的标记筛选分离群体，获得足量的重组单株。当基因区域比较大的时候，可以选择操作相对简单的标记来筛选重组单株，比如SSR标记。图2所示就是利用多态性的SSR标记RM253筛选三交F1分离群体的显色结果（每排64个样品，点样9次，共576个样品的分型结果）。

图2：标记RM253筛选分离群体示意图

03 如何分析重组单株？

要对重组单株进行基因型分型，就需要有多态性的标记。经典的图位克隆中对基因精细定位的过程，就是寻找多态性标记的过程。没有参考基因组，或者说参考基因组测序拼接不完整的时候，寻找多态性的标记尤为重要，特别是多态性的RFLP标记。

筛选多态性的RFLP标记，是从筛选BAC文库，构建基因区段遗传连锁图开始的。

图3：利用紧密连锁的标记筛选BAC文库示意图

获得阳性BAC克隆并且验证之后，就对阳性BAC克隆进行亚克隆。

图4 ：BAC亚克隆的插入片段酶切检测示意图

通过分子Southern杂交，挑选阳性亚克隆（图5）。

图5：BAC克隆酶切之后与其亚克隆进行分子杂交

对阳性的亚克隆，先筛选亲本多态性，具有多态性的亚克隆，才发展为一个新的RFLP标记（图6）。

图6：具有多态性亚克隆17E3对重组单株检测示意图

经过多轮的BAC文库筛选，阳性克隆验证，亚克隆，多态性筛选，重组单株分型，一步步的染色体步查，最终完成基因区段的物理图谱的构建，并且利用新的多态性标记对重组单株进行分析，缩小基因区段。

如图7所示，广亲和基因S5位点最后被缩小到分子标记F7与M31之间。图中所示的分子标记，除R2349和RM253之外，其余都是新筛选到的多态性的RFLP标记。

图7：广亲和基因S5区段的精细定位

利用图位克隆法构建基因区段的物理图谱，并对基因进行精细定位，需要耗费大量的人力和物力，上述广亲和基因S5区段的精细定位，花费了1个博士和2个硕士共3年的时间。

04 有了基因芯片以后

现在，水稻已经完成了全基因组测序，并且获得了高质量的日本晴参考基因组序列，以及近5000份水稻品种重测序数据。

双绿源研发团队，通过对近5000份水稻品种重测序数据进行分析，挑选代表性好、多态性高、染色体上分布均匀的SNP标记，设计了水稻绿色基因芯片GSR40K。利用GSR40K基因芯片，对任意两个品种进行基因指纹分析，都可以获得足量的多态性标记，再也不用花费大量的人力物力去筛选了。

如图８所示，利用GSR40K对重组单株进行分析，在某染色体上的０.３０－１.５６Ｍｂ区间含有５３个多态性的标记。

图８：利用GSR40K对重组单株进行分析

另外，利用GSR40K对重组单株进行分析，还可以剔除假的重组单株，保证结果的准确性。如图９所示，箭头所示的单株为假的重组单株。

图９：利用GSR40K对重组单株进行分析

利用GSR40K对重组单株进行分析，一周时间就可以获得结果，费用也很便宜，对比经典的图位克隆法，简直就是光速。

其实，基因芯片可以做的事，还很多

目录

⊙主效QTL快速定位

⊙基因精细定位和克隆

⊙功能基因鉴定

⊙品种纯合度检测

⊙品种指纹检测，用于品种保护

⊙覆蓋全基因组的遗传连锁图谱构建

⊙杂种优势预测

⊙导入系基因型精准鉴定

⊙种质资源分类

⊙品种基因组片段的籼粳特性分析

⊙品种定向改良和新品种培育

⊙品种培育的定制化

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