常見的酶都是蛋白質或者RNA，而DNA長期以來一直被認為是一種非常適合攜帶遺傳信息的分子，但其結構單調，因此其功能也缺乏多樣性的。在發現具有催化酶活性的RNA後，很明顯，具有特定序列和三維結構的核酸分子能夠進行特定的化學反應，其效率通常可與蛋白質酶媲美。其中瞭解最多的DNA酶（DNAzyme）是10–23，該酶是通過體外篩選的方式獲得(Santoro and Joyce 1997)，它能夠切割靶標RNA，該過程依賴於Mg2+。10–23包含一個15個核苷酸的催化結構域，該結構域的兩側為底物結合臂，底物結合臂能使10–23精確識別靶標RNA，底物結合臂的長度可根據RNA底物的序列而變化。當10–23與底物結合後，在預定的嘌呤-嘧啶連接處進行RNA切割，並且在G-U二核苷酸處觀察到最高的剪切活性,如下圖。

10–23切割RNA底物

多年來，已通過多種方式對10-23進行瞭化學修飾，以提高其在體內和細胞內的效率。大多數化學修飾都是針對底物結合臂，目的是增加10-23對RNA靶標的親和力。但是，這種化學修飾對提高DNA酶的催化活性構成瞭障礙，因為為增強RNA結合而選擇的修飾通常會導致產物抑制，因為酶-產物間親和力太強導致復合物無法從催化後狀態解離。

John C. Chaput團隊利用異種核酸（XNAs）對10-23進行修飾改造，異種核酸（XNA）提供瞭一種具有理化特性的新型分子化學型，可以在multiple-turnover條件下實現增強的生物穩定性而又不犧牲催化活性。

他們報道瞭經典的10-23 DNA酶的重新設計版本，該版本的酶在哺乳動物細胞中具有持久的基因沉默活性，DNAzyme的催化活性，同時還抵抗核酸酶的消化，該新設計版本的酶稱為X10-23。他們的結果表明，新的分子化學型可以大大提高DNAzyme的催化活性，同時這也表明分子設計是一種強大的方法，可以優化具有潛在治療價值的核酸酶,該成果發表在Nature chemistry.

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他們首先用2'-氟阿拉伯糖核酸（FANA）取代瞭底物識別域結合臂中的所有DNA殘基,新合成的10-23命名為F10-23。實驗結果表明，其酶活力有明顯的提高（圖1）。

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圖1. F10-23的酶動力學分析。

在F10-23的基礎上，他們用TNA替換催化結構域上的G2和U8 FANA殘基，同時在DNA的5’和3’各端添加一個不互補的TNA類核苷酸tT，修飾後的酶命名為X10-23。實驗結果顯示，X10-23的酶活力又進一步優於F10-23，見圖2。尤其在multiple-turnover條件下，X10-23的酶活力提高瞭近50倍。

圖2. X10-23結構及酶動力學分析。

作為一種DNA酶，穩定性是其最突出的特點，尤其是修飾後的X10-23，其穩定性要高於它的前輩10-23和F10-23。在人的肝臟微粒和人血清中處理21小時或者SVPDE處理90min,均顯示機會沒有降解（圖3）。

圖3. X10-23的生物穩定性分析。

在測試完X10-23的酶活力及生物穩定性後，John C. Chaput團隊進一步檢測瞭X10-23在細胞內切割RNA的活性。他們將GFP表達質粒與X10-23共轉染到HEK293T細胞中，然後觀察24h後的GFP熒光強度，並通過qRT-PCR對mRNA進行定量。實驗結果表明，X10-23能夠在細胞內顯著降解GFP mRNA（圖5）。

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圖5. HEK293T細胞中X10-23抑制GFP的表達。

總體來說，鑒於DNA酶具有位點特異的切割RNA的特性，可通過化學合成，易於改造和迭代更新，並且可針對不同的靶標RNA進行重新設計。

此外，隻需要Mg2+就可獲得較高酶活性，不需要其他輔助蛋白的作用。精準性也是DNA酶的一大特點，通過結合臂與靶標RNA的互補配對作用可精確識別靶標，因此DNA酶可進一步區分野生型mRNA和突變的mRNA。基於這一原理，DNA酶未來或可用於精準醫療領域。

實際上，已有多個團隊在嘗試，在此之前，已有研究顯示DNA酶具有非常低的細胞毒性(Cho et al. 2013)，相信在不久的將來其在疾病治療中的應用或可成為現實。

原文鏈接：http://www.nature.com/articles/s41557-021-00645-x

參考文獻：

Cho EA, Moloney FJ, Cai H, Au-Yeung A, China C et al., 2013 Safety and tolerability of an intratumorally injected dnazyme, dz13, in patients with nodular basal-cell carcinoma: A phase 1 first-in-human trial (discover). Lancet. 381(9880):1835-1843.

Santoro SW, Joyce GF, 1997 A general purpose rna-cleaving DNA enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 94(9):4262-4266.

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