前列腺癌是全球男性中最常見的癌癥，特別是在西方國傢，每年導致約375，000人死亡。轉化生長因子β（TGFβ）決定瞭胚胎發生過程中的細胞命運和分化，在幾種類型的惡性腫瘤中具有重要作用。

規范的TGFβ-Smad信號通路取決於I型TGFβ受體（TβRI）的激酶活性，並涉及Smad2，Smad3和Smad4復合物的形成，這些復合物調節某些基因的轉錄，包括SERPINE1，Snail1和金屬蛋白酶蛋白2（MMP2）。TβRI在其細胞外結構域被腫瘤壞死因子α轉換酶（TACE / ADAM17）切割，導致由Smad蛋白介導的TGFβ介導的生長抑制作用的喪失。

已經發現某些非規范的TGFβ信號通路受E3連接酶腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）的調節。該蛋白與TβRI結合，並在配體與受體結合時以受體激酶獨立的方式被激活，促進 MAP 激酶 TGFβ 活化激酶 1 的激活。TRAF6通過K160上內體蛋白APPL1的K63連接多泛素化，促進磷脂酰肌醇-3'-激酶（PI3K）-AKT途徑的激活，以響應胰島素刺激，並且響應於通過PI3K復合物中調節亞基p85α的K63連接的多泛素化的TGFβ刺激。TRAF6還激活蛋白水解酶，即γ-分泌酶復合物中的TACE / ADAM17和presenilin 1，以釋放TβRI的細胞內結構域（ICD）。在TRAF6泛素化K178後，TβRI-ICD進入細胞核，促進促侵襲基因和TGFBR1的轉錄。

最近表明，內體接合蛋白APPL1和APPL2與TβRI-ICD相關，增強TβRI-ICD對TGFβ刺激的核積累，通過MMP2/MMP9促進前列腺癌細胞體外侵襲性，與人前列腺癌的侵襲性呈強相關性。

此外，患者清除細胞腎細胞癌（ccRCC）細胞中TβRI-ICD的量已被證明與生存率低下相關。

TGFβ信號通路在腫瘤進展中具有雙重和關鍵作用。在正常細胞和腫瘤發生的早期階段，它通過抑制增殖和誘導細胞凋亡來充當腫瘤抑制因子。TGFβ通過下調MYC的表達和上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（包括p15）的表達來抑制多種細胞類型的增殖，包括上皮和內皮細胞，角質形成細胞和白細胞墨水4B和 p21。然而，在晚期癌癥中，TGFβ通過誘導上皮 - 間充質轉變，促進腫瘤侵襲和轉移以及抑制免疫系統來促進腫瘤發生。

盡管有這些發現，但對TGFβ在有絲分裂中的作用知之甚少。有趣的是，TGFβ可以促進某些間充質細胞和癌細胞的增殖，但對生長刺激的機制知之甚少。作為增殖的刺激物，TGFβ誘導人腎成纖維細胞中成纖維細胞生長因子2的表達，以及膠質瘤和骨肉瘤細胞中血小板衍生的生長因子的表達。在正常的前列腺上皮細胞中，TGFβ通過抑制增殖和誘導細胞凋亡來充當生長抑制因子，而在前列腺癌細胞中，其對TGFβ誘導的生長停滯失去瞭敏感性，TGFβ可以促進腫瘤細胞生長。例如，TGFβ刺激前列腺癌細胞系TSU-Pr1中的細胞增殖，在DU145和PC-3細胞系中僅引起短暫的增殖抑制，而對LNCaP前列腺癌細胞的增殖沒有影響。有趣的是，TGFBR1在幾種癌癥中的高表達，包括結直腸癌，膠質瘤，肺鱗癌，胰腺癌，胃腺癌和浸潤性乳腺癌，已被證明與生存率低有關。

極光激酶A（AURKA）和B（AURKB）在許多腫瘤中過表達，包括乳腺癌，肺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺瘤。AURKB是染色體乘客復合物（CPC）的一個組成部分，其中還含有內著絲粒蛋白（INCENP），生存素和硼化素。AURKB 綁定到 INCENP 的保守 C 端 IN-box 區域，Thr-Ser-Ser（TSS）基序所在的位置，該基序由AURKB磷酸化，有助於AURKB激活和穩定復合物。

AURKB：INCENP復合物也被提出有利於反式中AURKB的自磷酸化，並且對AURKB晶體結構的研究揭示瞭其形式。

在相間期，CPC定位於異染色質中，並且在細胞進入有絲分裂後，組蛋白H3在Ser10（H3pS10）處的AURKB磷酸化促進CPC從染色體臂到內著絲粒的去除。在分析期開始時，CPC從染色體釋放並重新定位到紡錘體中區，在那裡形成AURKB的磷酸化梯度。在細胞分裂過程中，CPC靶向裂隙溝和中體。由於幾種不同癌癥類型中AURKB表達增加與預後不良之間存在關聯，因此正在臨床試驗中測試幾種AURKB抑制劑。

最近一個題為“泛素連接酶TRAF6和TGFβ I型受體與極光激酶B形成復合物，有助於癌細胞中的有絲分裂進展和細胞分裂”的研究：進行瞭微陣列分析，以在去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）細胞中尋找由APPL1/ 2蛋白調節的基因。研究瞭在沒有外源性TGFβ的情況下，在10%FBS培養的癌細胞系中TβRI和TRAF6在有絲分裂中的作用。還研究瞭TRAF6在有絲分裂中泛素化AURKB的分子機制以及AURKB-TβRI復合物在癌細胞系和組織微陣列中的形成。

研究發現：在有絲分裂和細胞分裂過程中，AURKB-TβRI復合物在CRPC和KELLY神經母細胞瘤細胞的中體中形成。TRAF6誘導瞭K85和K87上AURKB的多泛素化，突出在AURKB表面以促進其活化。患者腫瘤組織切片中的AURKB-TβRI復合物與前列腺癌的惡性腫瘤相關。AURKB–TβRI 復合物可能成為有發生侵襲性 PC 風險的患者的預後生物標志物。

之前已經在癌細胞中確定瞭一種信號通路，其中TβRI以TRAF6依賴性方式經歷蛋白水解裂解，產生TβRI-ICD，當TβRI被TRAF6在殘基K178上多泛素化時進入細胞核。之前還報道瞭APPL1通過APPL1的C端與TβRI-ICD相互作用，並且復合物以TRAF6依賴性的方式通過微管易位到細胞核。一旦進入細胞核，TβRI-ICD通過與其啟動子區域結合來誘導TGFBR1和其他基因的表達。在這份報告中，AURKB被鑒定為體外CRPC細胞中APPL1 / APPL2依賴性途徑的靶基因。在有絲分裂進展過程中，TRAF6在CRPC細胞中被發現是自泛素化的，並且在AURKB的保守甘氨酸富環中，通過K85/87上的K63連接的多泛素化來促進AURKB激酶活性。此外，APPL1和TβRI-ICD在CRPC細胞中有絲分裂和細胞分裂期間與AURKB形成復合物。APPL1，TRAF6或TGFBR1的敲低抑制瞭CRPC細胞的增殖或存活，這表明它們是CRPC在體外生長所必需的。

根據目前的發現和以前的報告，故而提出TβRI-ICD與AURKB一起作用，以TRAF6依賴性的方式參與有絲分裂和細胞分裂的調節，TRAF6導致K85和K87上AURKB的多泛素化，如下所述。有絲分裂是一種非常復雜且高度受控的生物過程，其中極光激酶傢族的成員已被證明是染色體分離所必需的。Aurora激酶傢族成員AURKA，AURKB和AURKC具有控制正常細胞有絲分裂進展的關鍵功能，並且在幾種形式的癌癥中經常過度表達和失調，包括前列腺癌，導致疾病的進展。極光激酶的N端和C端結構域高度保守，當它們以非活動形式存在時，它們以封閉的形式折疊。Aurora激酶的N端結構域被認為對其亞細胞定位很重要。在極光激酶的激酶結構域的開始，具有與結合ATP的保守GKGK基序（圖S3c，S3g）的富含甘氨酸的環;分子的這一部分是柔性的，並且與活化環緊密接觸（圖3k）。K106對於激活AURKB至關重要，該殘基上的突變（K106R）導致AURKB失活。數據顯示，當AURKB活躍時，AURKB激酶結構域開始時，TRAF6誘導的K85和K87上的K63連接多泛素化發生在癌細胞有絲分裂進展期間（圖3）。AURKB的K85和K87暴露在表面上並與兩個α-C螺旋和分子的活化環緊密接觸（圖3k和圖S3g）。

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圖3，TRAF6介導瞭AURKB的K63連鎖多泛素化。（a-b）PC-3U細胞用或不用TRAF6 siRNA處理，與雙胸苷阻斷同步，並在不同時間段（a）後通過免疫印跡（IB）進行分析，有或沒有用諾考達唑孵育12小時（b）。（c）同步PC-3U細胞的裂解物用AURKB抗體免疫沉淀（IP），然後用針對TβRI，APPL1和TRAF6的抗體進行免疫印跡。（d）用Flag-AURKB和HA標記的野生型（WT）或突變的泛素轉染的同步PC-3U細胞的裂解物，使用Flag抗體進行免疫沉淀，然後使用HA抗體進行免疫印跡。箭頭指向重免疫球蛋白鏈。（e）將PC-3U細胞與雙胸苷阻斷同步，釋放到具有10%FBS的新鮮培養基中，在指定時間收獲，然後進行體內泛素化測定。S 是饑餓 （f） 的縮寫。使用或不用TRAF6 siRNA處理的同步PC-3U細胞的裂解物使用Flag抗體進行免疫沉淀，然後使用HA抗體進行免疫印跡。箭頭指向重免疫球蛋白鏈。以平均值±SEM，N = 3 [學生的t檢驗，**p <0.01]（g）用HA標記的WT泛素和標記的WT或突變體AURKB轉染的同步PC-3U細胞的裂解物，使用Flag抗體進行免疫沉淀，然後使用HA兔抗體進行免疫印跡。數據表示為平均值±SEM，N=3 [學生的t檢驗，* p <0.05]。（h）用WT或突變體GFP-AURKB轉染PC-3U細胞，然後用針對H3pS10的抗體進行免疫印跡。數據顯示為平均值±SEM，N = 3 [學生的t檢驗，**p <0.01]。（i）用WT或突變GFP-AURKB轉染PC-3U細胞，然後用TβRI（紅色）染色。n=20， N=3， 數據表示為平均值±SEM [學生的 t 檢驗， ** p < 0.01， ***p < 0.001]。（j）用WT或突變體GFP-AURKB轉染PC-3U細胞，然後用Hoechst 33342染色。N=3 [學生的 t 檢驗，* p < 0.05]。（k） AURKB激酶結構域的示意圖。從 http://alphafold.ebi.ac.uk 下載人類AURKB的結構文件AF-Q96GD4-F1-model_V2pdb，並上傳到EzMol界面2.1（英國倫敦帝國理工學院）進行可視化和描繪。活化環，α C螺旋（氨基酸殘基110至131;alphaC'（aa 110至aa 115）和αC（aa 118至131）），K85和K87以及G84，G86，G98及其相應的側殘基分別以橙色，洋紅色，紅色和藍色表示。請註意，K85和K87（紅色）的側鏈從激酶結構域中伸出。

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圖 S3。AURKB 和TbRI之間的共定位取決於 TRAF6 和突變體 AURKB 的特征。(a-b) 當 PC-3U 和 MEF 細胞中 TRAF6 表達降低時，免疫熒光顯示 AURKB 和 TβRI 在有絲分裂期間的共定位減少。(c) TRAF6 泛素化的共有基序存在於幾個物種的 AURKB 中。相同類型的氨基酸標記為 (*) 疏水性、(&) 極性、(X) 任何氨基酸殘基。(K) 是受體賴氨酸殘基。（ d ）用Flag標記的WT和突變體AURKB轉染的PC-3U細胞的裂解物用Flag抗體免疫沉淀，然後用TRAF6抗體進行免疫印跡，如圖所示。(e-f) 對免疫沉淀的 Flag-AURKB 或其突變體進行體外激酶測定。如圖所示，Flag-AURKB 及其突變體的表達和等量加載由 Flag 免疫沉淀物或總細胞裂解物 (TCL) 的免疫印跡等分試樣控制。通過磷光成像儀檢測摻入的放射性。用考馬斯亮藍染色凝膠後檢測到的磷酸化蛋白和總蛋白的遷移位置由箭頭 (e) 顯示。組蛋白 H3 用作底物，通過免疫印跡法檢測 H3pS10 (f)。(g) 人類 AURKA 和 AURKB 結構域的結構。AURKA 和 AURKB 由一個控制蛋白質定位的 N 端結構域、一個包含激活環和降解盒 (D-box) 的大而保守的激酶結構域和一個短的 C 端結構域構成。AURKA 和 AURKB 還包含一個 KEN 基序和一個調節降解的 D-box 激活基序。在 AURKA 和 AURKB 之間，總氨基酸序列的同源性百分比為 57%。並且激酶結構域的同源性百分比被評估為 71%。註意 AURKB 激酶結構域開頭富含甘氨酸的環中的 K85 和 K87。

AURKB結構在AURKB的活化回路中在T232上自磷酸化時采用活性激酶形成。對於AURKA，已經表明，當一個分子作為活性激酶而另一個分子作為底物時，催化結構域中的磷酸化發生在不對稱的二聚體中。Elkins報道瞭二聚體AURKB反式活化的類似機制（Elkins JM，Santaguida S，Musacchio A et al.Crystal structure of human Aurora B in complex with INCENP and VX-680.J Med Chem. 2012; 55: 7841-7848）。INCENP與AURKB的N端結構域的結合以變構方式有助於誘導其作為激酶的活性構象，並且已經報道瞭類似的AURKC激活，而AURKA的變構激活涉及它與TPX2的結合。部分活性的AURKB接下來在保守的TSS基序中磷酸化INCENP，導致AURKB的完全活化。

這個研究數據表明，TRAF6誘導的K63連鎖KURKB在K85和K87上的多泛素化可能有助於變構活化和穩定其活性形式的AURKB復合物形成（圖3），這一觀點得到瞭研究發現的支持，即K85和K87的雙重突變抑制瞭AURKB的激酶活性，並且由於變構誘導的3D結構，酶的泛素化可能導致它們的活化以及穩定它的主動構象。由於富含甘氨酸的環參與ATP結合，另一種可能性是K85和K87的突變擾亂ATP結合，從而抑制AURKB的激酶活性。然而， 兩個賴氨酸殘基的突變並沒有阻止 AURKB 的自磷酸化 （圖 S3e）， 這與 Bose 及其同事先前的出版物一致（Bose A，Sudevan S，Rao VJ et al.Haploinsufficient tumor suppressor Tip60 negatively regulates the oncogenic Aurora B kinase.J Biosci. 2019; 44: 147），這表明這種可能性不太可能。此外，AURKB中受體賴氨酸K85和K87的突變不影響其內在激酶活性（圖S3f）。AURKB的富含甘氨酸的序列是靈活的，並與激酶的催化位點相互作用。因此，該區域的泛素化可能會改變其構象，從而促進AURKB的激酶活性，如上所述。另一種可能性是，AURKB在K85和K87上的多泛素化促進其二聚化並促進T232上的自磷酸化，這已被證明發生在二聚體AURKB：INCENP復合物中的反式中。重要的是，TRAF6被發現是自泛素化的，這與其激活一致，在有絲分裂進展期間（圖3e），同時AURKB是活躍的，即活性TRAF6對AURKB有影響以調節癌細胞的增殖。

通過共聚焦成像，研究發現APPL1和AURKB以及AURKB和TβRI在有絲分裂和細胞分裂過程中在中體中共定位。AURKB和TβRI的共同定位依賴於TRAF6（圖S3a-b）。此外，通過共免疫沉淀，AURKB被證明與APPL1，TβRI和TRAF6相互作用（圖3c）。AURKB被發現與APPL1的所有三個結構域結合（圖1m），而TβRI與APPL1的C端結合。在有絲分裂進展和細胞分裂過程中，這些相互作用可能是動態的，並且隨著時間的推移，這些復合物的確切組成仍有待確定。然而，我們的數據表明，AURKB和TRAF6在有絲分裂進展過程中結合有助於AURKB活性，並且在晚期端粒和細胞分裂過程中APPL1，AURKB和TβRI定位於中體。此外，TβRI定位到中體依賴於AURKB的K85和K87上的K63連鎖多泛素化，這表明TβRI與泛素化的AURKB相關（圖6）。

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圖1，APPL1和2促進AURKB，BIRC5，CDCA8和KIF2C表達。（a） 將人前列腺癌PC-3U細胞轉染為對照或1號APPL1和APPL2 siRNA。從細胞中提取RNA，並進行微陣列分析。（b）qRT-PCR分析圖a所示的用或不用1號APPL1和APPL2 siRNA處理的細胞的基因。通過表達siRNA抗性構建體克服瞭siRNA的抑制作用;N = 4，數據顯示為平均值±SEM [學生的 t 檢驗， * p < 0.05， ** p < 0.01， ***p < 0.001]。（c）PC-3U細胞與雙胸苷阻斷同步，並用1號APPL1和APPL2 siRNA處理。在不同時間釋放細胞並制備細胞裂解物，並進行免疫印跡。（d）將PC-3U細胞轉染有或沒有1號APPL1和APPL2 siRNA，與諾考達唑一起孵育12小時，並通過免疫印跡進行分析。（e） 免疫熒光和共聚焦成像顯示 AURKB（綠色）和 APPL1（紅色）在端粒期和細胞分裂過程中的共定位。（f-k）面板 e 的兩個 Z 堆疊圖像的正交視圖（XY、XZ 和 YZ）。（g， j）XZ 視圖。（h， k）YZ 視圖。比例尺，20μm.（l）APPL1蛋白和突變體的示意圖。（m）用HA-AURKB和不同的APPL1結構域短暫轉染的PC-3U細胞同步，然後用抗HA抗體進行免疫沉淀，並使用GFP抗體進行免疫印跡。非轉染（NT）。

圖6，TβRI-ICD信號通路及其參與有絲分裂進展的示意圖。TβRI通過TACE / ADAM17和presenilin 1在活化的γ - 分泌酶復合物中經歷蛋白水解裂解的非規范途徑產生細胞內結構域（TβRI-ICD）。TβRI-ICD的核易位需要內體蛋白APPL1 / 2和完整的微管。在細胞核中，TβRI-ICD與轉錄共激活劑p300形成復合物，並促進促侵襲基因TGFBR1，MMP2 / MMP9以及AURKB和BIRC5（編碼生存素）的表達。在細胞分裂過程中，TβRI-ICD和APPL1與AURKB形成復合物。TRAF6促進有絲分裂期間K85和K87上K63連接的AURKB多泛素化，其與TβRI-ICD一起是正常細胞分裂所必需的。

早期的研究表明，在人雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP中敲低AURKB不會影響腫瘤細胞的存活。相反，在更具侵襲性的雄激素依賴性PC3細胞系中敲低AURKB，導致體外凋亡並減少體內異種移植裸鼠模型中的腫瘤生長，提示 AURKB 在雄激素依賴性前列腺癌細胞中的重要作用。之前的一項研究描述瞭CRPC中與AURKB相關的腫瘤促進和促生存作用（Chieffi P,Cozzolino L,Kisslinger A等Aurora B的表達與前列腺癌惡性腫瘤直接相關，並影響前列腺細胞增殖。前列腺. 2006; 66：326-333）。這一結果，以及目前APPL1-TβRΙ-ICD途徑控制AURKB表達並且TβRΙ與AURKB相互作用的發現，支持瞭TβRI部分通過其在細胞分裂和細胞分裂中的作用促進細胞增殖的觀點。因此，正常上皮細胞中由規范TβRI-Smad信號通路轉導的生長抑制作用，與改研究報道的 TβRI-ICD 在有絲分裂進展和細胞分裂過程中與 AURKB 復合物中的作用不同。TGFBR1的敲低導致癌細胞多核化的觀察結果（圖2e）強調瞭TβRI在癌細胞分裂中的功能作用。

圖2，TβRI在有絲分裂期間與AURKB共定位。（a-c）免疫熒光實驗顯示，在人前列腺癌（PC-3U）（a）和人神經母細胞瘤（KELLY）（b）細胞的有絲分裂過程中，AURKB（綠色）和TβRI（V22，紅色）以及TβRI（V22，綠色）和β微管蛋白（紅色）在整個PC-3U有絲分裂（c）中共同定位。比例尺，20μm.（d）在冰上處理PC-3U細胞30分鐘後，TβRI和AURKB的共定位降低。（e）敲低TGFBR1後計數多核細胞。以平均值表示的數據±SEM，N=3 [學生的 t 檢驗，*p < 0.05]。比例尺，20 μm.（f）基因集富集分析（GSEA）根據其與TGFBR1表達的相關性進行排名，產生34個顯著富集的基因集（調整的p值≤0.05，並使用Benjamini-Hochberg程序調整p值）。脊圖顯示瞭核心富集基因的相關系數的分佈，即對基因集富集貢獻最大的基因。基因集按歸一化富集評分排序。顏色表示調整後的 p 值。（g）標志性有絲分裂紡錘體（左）和G2 /M檢查點（右）基因集的GSEA圖顯示它們與TGFBR1相關基因有很強的相關性。上圖顯示瞭基因集基因在所有基因的排名列表中的相關系數和位置，下圖顯示瞭運行富集評分。

AURKB在各種癌癥中經常過度表達，包括前列腺癌。有絲分裂的錯誤可導致基因組不穩定，這是腫瘤發生的一個重要標志。如前所述，Aurora激酶參與有絲分裂的多個步驟，包括中心體成熟，雙極紡錘體組裝，染色體凝聚，對齊和細胞分裂。由於它們在調節有絲分裂方面的特殊作用，它們是癌癥治療的靶標候選者，抑制劑正在臨床試驗中進行測試。較高的AURKB表達也表明前列腺癌的患者生存率較差且更具侵襲性（圖4a-b）。此外，在前列腺癌患者中，TGFBR1表達與有絲分裂紡錘體和G2 / M檢查點高度相關（圖2f-g）。此外，AURKA和AURKB在神經內分泌型CRPC中的表達高於CRPC腺癌（圖4c），與神經內分泌型CRPC患者的預後不良一致。總之，數據支持這樣一種觀點，即AURKB和TβRI在細胞有絲分裂和細胞分裂過程中形成功能復合物以參與細胞增殖，並且TRAF6誘導的AURKB泛素化起重要作用，因為AURKB K85 / 87R突變體沒有將TβRI招募到中體（圖3i）。

圖4 AURKB的表達與不同癌癥的預後不良相關。（a） Kaplan-Meier 圖說明瞭 AURKB 在前列腺癌、ccRCC 或肺腺癌中低表達與高表達的患者生存的影響。代表性圖像來自人類蛋白質圖譜，基於TCGA泛癌圖譜數據庫的數據。（b）TCGA中原發性前列腺腫瘤中AURKB的表達在格裡森組之間有所不同[學生的t檢驗，***p<0.001]。腫瘤根據其格裡森評分進行分組。（c） AURKA和AURKB在CRPC-NE和CRPC-Adeno中的表達[曼恩-惠特尼U檢驗，***p <0.001]。（d） AURKB和TGFBR1在CRPC-NE和CRPC-腺素中的表達均相關。皮爾遜相關性分析用於數據分析。

綜上所述，該研究中提出的研究結果證明瞭TβRI在調節癌細胞增殖方面以前未知的功能，即當細胞進入有絲分裂時通過與AURKB的相互作用。該功能與眾所周知的TβRI的功能明顯不同，TβRI通過規范的Smad信號通路作為轉錄反應的上遊調節劑，以響應TGFβ。TRAF6，它與TβRI有關，導致 AURKB 在特定殘基上的多泛素化 （K85/87），從而導致 H3pS10 測量的 AURKB 活性（圖 6）。鑒定TβRI-AURKB復合物在癌細胞有絲分裂和細胞分裂中的關鍵功能，為開發依賴於該途徑的侵襲性癌癥的生物標志物提供瞭基礎。