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//依然是正文前的碎碎念

自從開瞭專欄之後，本司機的私信區似乎也熱鬧瞭起來，時不時會收到“為什麼實驗做不出來”的求助問題。一般情況下，隻要能力范圍內，我都會盡力解答。（但是那種求醫問藥的一概不答復，比如問經期怎麼調理身體的，我這枚可愛的藍孩紙怎麼可能知道。請上醫院謝謝。）

在處理這些問題的過程中，往往要來來回回好多次私信才能把問題瞭解到點上，從而也發現瞭一些共通的癥結所在，那就是區別新司機和老司機其中一個重要指標：會不會做對照實驗。這也是本文的創作靈感。

今天這篇文章，可能邏輯性會稍微差一些，正如題目中的“漫談”二字。說老實話，雖然從高中生物學課堂開始，老師就在那裡敲黑板給大傢歸納對照組的類型。隻是在實際科研中，高度概括的語言未必能給予切實的指導。而對於老司機來說，設計對照實驗已變成瞭一種本能，無需經過歸納再演繹的過程，因此要從頭到尾系統地講解，也還挺困難。所以想來想去，這篇文準備以舉超多例子的形式，“東拼西湊”式地給各位新司機演示一下，老司機是如何設計對照組的。

//下面開始正文

對照實驗，或者說對照組（英文是control，也就是野雞資訊網站的野雞小編筆下的“控制組”，真素耿直的翻譯厚），是任何生物醫學類實驗中最重要的組成部分。對照實驗不光能作為實驗儀器設備、試劑耗材、操作技術的質控手段，還將決定最終所獲得的實驗數據是否具有足夠的說服力。

一般地，常見的對照實驗可以簡單粗略地分為四大類：陽性對照，陰性對照，相互對照，和自身對照。（本文的末尾還將介紹除這常見的四種以外的對照實驗。然而，請不要死記硬背，也無需強硬地為某一種特定的對照進行歸類。）

一、陽性對照

陽性對照（Positive control）是指按照當前實驗方案（如儀器參數設定、試劑配比、操作流程等）一定能得到預期結果的對照實驗。假設陽性對照實驗出不來預期結果，那麼就表示一定有某一個環節出瞭差錯，比如儀器沒有校正、實驗方案錯誤、實驗人員手滑加錯試劑之類的。從這個角度來講，陽性對照具有質控的意義。也就是說，有瞭陽性對照，當實驗失敗時，就有助於我們一步一步地排查問題。

更重要地，陽性對照還有支持陰性結果的功能。

例1：研究者為瞭證明溶瘤病毒M1無法在不敏感的腫瘤細胞中誘發致死性的內質網應激（ER stress，以CHOP蛋白表達為指標），用western blot的方法檢查瞭M1病毒感染後不同時間點的CHOP表達水平，發現均沒有升高（沒有條帶）。在最後的兩個泳道，研究者使用瞭衣黴素（Tunicamycin）作為陽性對照。衣黴素是一種確定能夠引起內質網應激、誘導CHOP表達的化合物。假設沒有這個陽性對照組，而隻是呈現給讀者光禿禿的空白泳道，那麼根本無法說明“M1病毒無法在這些細胞中引起內質網應激”這個問題，而有可能是CHOP抗體出瞭問題、實驗沒做好，或者根本就是剪一段空白的膜、捏造出來的數據。

二、陰性對照

陰性對照（Negative control），和陽性對照相對，是指按照當前的實驗方案一定不會得到正面結果（比如電泳不會有條帶，絕對不會長出克隆，細胞絕對不會死等）的對照實驗。陰性對照同樣具有質控意義。比如本司機開瞭那麼多年車，在做雙酶切克隆後的連接、轉化實驗時，依然習慣性地加一個無外源片段、僅含有酶切質粒的對照組。理論上，這樣的一個陰性對照組，在最後是絕對不可能長出任何克隆的。如果有，那就說明很可能是酶切不充分。如果陰性對照組長的克隆數量遠少於實驗組，那麼說明問題還不是很嚴重。如果大傢幾乎長得一樣多，那麼實驗還是重做為好，不用浪費時間挑克隆鑒定瞭。

相應地，陰性對照最重要的意義，是支持實驗處理組中所獲得的陽性結果。

陰性對照有許許多多的形式，需要根據具體的實驗目的來設計。

例2-1：為瞭研究某化合物是否具有抗腫瘤的作用，用該化合物處理體外培養的腫瘤細胞一段時間後，進行活細胞計數。這一類經典的藥理學實驗通常涉及溶劑對照（Vehicle control）。意思是，每一種化合物都有相應的溶劑，比如水、PBS、DMSO、乙醇等。如果是水溶性的，一般不會有多大的問題。當加入體積低於細胞培養體系1%時，此時可以僅做空白對照，即陰性對照組中不需要加入相應溶劑，留空不處理即可。因為水、PBS、生理鹽水之類常用的水性溶劑，是公認不會對培養細胞產生任何影響的。然而，像DMSO、乙醇等有機溶劑，當濃度達到一定量時，就會產生細胞毒性瞭。如果加入的濃度過高，同時又沒有溶劑對照，那麼到時候細胞死瞭，我們就搞不清楚，到底是化合物殺死瞭細胞，還是溶劑本身的毒性。

在臨床試驗中，還會涉及安慰劑對照（Placebo control）。安慰劑是指物理特性（如大小、顏色、重量、劑型、味道等）與試驗藥物相同，但卻不含有試驗藥有效成份的試劑。由於安慰劑效應一直都是臨床研究中的迷之領域，因此在臨床藥物試驗中，是不可能出現完全不處理的空白對照的。然而需要指出的是，對於重癥疾病是不可以設置安慰劑組的，要盡可能給予目前認為有效的藥物作為對照，否則就是在害人瞭。

例2-2：為瞭研究某基因是否具有抑制上皮細胞凋亡的作用，采用轉染siRNA的方法抑制該基因的表達，後進行凋亡細胞計數。所有涉及核酸轉染的實驗，從最嚴格的角度來講，一定會涉及空白對照、轉染對照（Mock control，比如隻加轉染試劑），以及無義對照。其中最重要的是無義對照。本例中，無義對照指的是和所用的siRNA在化學結構上幾乎一致（長度、修飾方式等）、但序列設計並不靶向目的基因的對照RNA。它可以是一段亂碼序列（Scramble
control），或者靶向非相關基因（比如靶向GFP、Luciferase等這些在哺乳動物細胞中並不存在的基因）。而如果轉染的是裝在質粒上的shRNA，那麼無義對照就是一個質粒，表達亂碼序列或者非靶向序列。通常情況下，轉染對照並不是必需的。然而，轉染手段同樣也會幹擾實驗指標的測定。比如常用的轉染試劑是脂質體，我以前做過實驗，單獨加入這樣的轉染試劑，會導致細胞脂代謝基因表達發生變化。有關轉染試劑及轉染物（如小分子RNA）如何影響基因表達，有許多相關文獻，感興趣的可自行搜索。

例2-3：在一些涉及免疫學或者抗體的實驗時，往往需要添加同型對照（Isotype control），或者說同型抗體對照。同型抗體是指和實驗組的一抗具有相同動物來源（兔、小鼠、山羊等）、相同抗體類別（IgG、IgA、IgM等）的非特異抗體。任何抗體都不能保證在任何情況下，都完美地隻和一種抗原特異結合。一旦實驗條件沒有優化好，非特異結合就會被放大。因此，同型最重要的意義就是佐證實驗組抗體所獲得的數據是特異的。比如在下圖左方的免疫共沉淀實驗中，第三條泳道用的就是IgG同型對照，可以發現在箭頭所指位置，使用同型對照並無法獲得特異條帶。如果一抗帶有修飾（如熒光標記），那麼同型對照也必須帶有同樣的修飾。比如下圖右方的流式實驗，由於F4/80抗體攜帶eFluor450熒光標記，那麼同型對照抗體也必須有同樣的熒光標記。其他的涉及免疫學的實驗，比如染色質免疫共沉淀（ChIP），也一樣需要添加同型對照。（但一般而言，不需要為western blot實驗添加同型對照，因驗證抗體特異性最好的指標是過表達及敲除目的基因，看特異蛋白條帶與非特異條帶的變化。）

例2-4：在某些涉及復雜手術操作的動物實驗中，我們需要做假手術對照（Sham surgery control）。假手術是指對動物進行和實驗組相同的手術處理，但並不給予實驗刺激。如下圖，為瞭研究缺血對神經元的損傷以及化合物Triol對神經元的保護作用，研究人員采用夾閉腎下腹主動脈血管的方法制作脊髓缺血模型（ISC）。而假手術是指，同樣暴露動脈，但並不給予夾閉。這樣就可以排除在夾閉之前的所有手術操作對脊髓神經元造成瞭損傷。也就是說，一個完美的假手術對照，應該是無限接近於正常的、不做任何處理的對照。同時我們也可以看到，為瞭研究化合物Triol的作用，研究者也設置瞭溶劑對照。

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例2-5：在涉及遺傳學的實驗中，我們往往需要做等遺傳背景對照（Isogenic control）。比如，為瞭獲得A基因敲除的小鼠，我們可以拿Cre小鼠和flox A小鼠（即A基因兩側含有LoxP位點，flox為“Flanked by LoxP”的縮寫）進行雜交，獲得子代做實驗。與此同時，我們必須拿Cre小鼠和A基因不被flox的小鼠的雜交後代，作為等遺傳背景對照。在細胞水平，為瞭研究B基因的作用，我們可以在某細胞系中過表達B基因。同時，我們就必須拿相同的、但不過表達B基因的細胞系作為對照。或者更嚴謹地，必須拿含有過表達載體的相同細胞系作為對照。

三、相互對照

相互對照是指一個實驗內，各組之間互為對照，或者具有相同處理條件的實驗之間，相互形成對照。簡而言之，相互對照有“組間對照”及“實驗間對照”兩種形式。

例3-1：研究人員為瞭證明，幹擾BMP2基因的表達，可以阻斷流體剪切力（FSS）誘導的SP7基因瞬時表達升高，從而設計瞭下面的實驗組。無義幹擾片段對照（NC），無義幹擾片段對照+流體剪切力，幹擾BMP2（siBMP2），幹擾BMP2+流體剪切力。我們可以看到，這4個組之間，是相互呈對照關系的。比如，在不幹擾BMP2的情況下，FSS誘導瞭SP7的表達，對照組是NC。單獨siBMP2，在短時間內並不能降低SP7的基線水平，對照組同樣是NC。在siBMP2的基礎上進行FSS處理，並不能誘導SP7的表達，對照組是NC+FSS以及siBMP2。本例中，實驗涉及瞭兩種處理（基因幹擾和流體剪切力），每種處理分別都有一個陰性對照和一個實驗處理，因此就會形成一個2×2=4的組合設計。此外，由於SP7基因隻會短暫地升高（12小時），因此還有一個24小時時間點作為相互對照。這種組間相互對照的思想，是為瞭確保實驗處理的變量是單一的。也就是說，光做NC和siBMP2+FSS，發現SP7表達沒有變化，是不能說明siBMP2發揮瞭作用，而有可能是FSS本身就失效瞭。

例3-2：研究人員發現，AKT和PI3K的激酶抑制劑可以抑制細胞的葡萄糖攝取，然而，另外兩個經典激酶通路ERK和mTORC1的抑制劑，卻不具有同樣的功能。（下圖右方）然而ERK和mTORC1的抑制劑沒有發揮作用，到底是因為實驗處理不當，還是說這兩個信號通路在這個細胞中就不具備調控葡萄糖攝取的功能呢？於是，研究人員設計瞭另外一個對照實驗（下圖左方），通過western
blot的方法，發現這4種抑制劑均發揮瞭作用，藥物的處理並沒有問題，然而隻有抑制AKT和PI3K才能出現抑制葡萄糖攝取的結果。本例中，western blot和葡萄糖攝取實驗之間便形成瞭相互對照。這種實驗間的相互對照，是為瞭保證證據鏈的完整性，不出現斷層。

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四、自身對照

自身對照是指對照組即為處理組樣品的本身，這是一種比較處理前後指標變化的方法，通常所獲得的數據是配對型的（一前一後）或者時間序貫型的（處理後不同時間點）。

例4：研究人員為瞭證明球培養的腦膠質瘤GBM39細胞系的EGFRvIII蛋白的表達受到動態調控，利用流式細胞分選的方法，將混合群中的高表達EGFRvIII的細胞分選出來後進行培養，並在不同時間點取樣進行EGFRvIII表達量檢測。可以發現，在剛分選出來時，EGFRvIII處於高表達狀態。但隨著時間的推移，灰色的峰逐漸往左移動，即EGFRvIII的平均表達水平越來越低，同時變異度增大，意味著又回歸高低表達混合的狀態。本例中，處理條件僅有一個，即分離出高表達的細胞。而隨後的檢測，都在同一份細胞樣品中進行（每次取一部分），觀察這一份樣品的指標變化。因此對照組就是這份樣品本身。（當然，該實驗還涉及瞭另一個對照，即未分選的親代混合細胞，作為一個基線存在。）在臨床研究中，也大量涉及瞭自身對照，比如觀察服藥前後血壓的變化等。

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五、其他對照實驗類型

還有一類對照，並不經常出現，老司機才能玩得熟練。由於沒有統一的定義，這裡姑且把它命名為演繹對照好瞭。演繹對照是指所施予的處理、刺激或者條件，與實驗組具有兼容性或者排斥性的對照，而根據科學假說的邏輯進行演繹，會對應地得到與實驗組相近或者不同的結果。

例5：研究人員發現，人胰星狀細胞（hPSC）的條件培養基（CM），能夠增強胰腺癌8988T細胞的耗氧速率（OCR）。條件培養基經凍融、煮沸、過3 KDa截留柱後，仍然保持瞭這個功能，說明是條件培養基中的小分子代謝物在起作用。通過質譜鑒定，發現瞭丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）這兩種非必需氨基酸（NEAA）具有預期的存在模式（請忽略其中的細節）。因此，為瞭研究在條件培養基中，到底是哪一種氨基酸在起作用，作者設計瞭如下圖的實驗。首先是相比胰腺癌8988T細胞本身的條件培養基，胰星狀細胞hPSC的條件培養基增強瞭OCR。而既然質譜的鑒定結果是非必需氨基酸，那麼就在普通培養基中添加NEAA混合物，發現得到瞭和hPSC條件培養基相同的結果。但僅僅添加丙氨酸，也出現瞭相同的效應。然而，加入天冬氨酸，則無法得到顯著結果。而甘氨酸（Gly）和半胱氨酸（Cys）雖然也同屬非必需氨基酸，但在質譜實驗中並沒有出現的，因此如同預期一般，這兩者並不能增強OCR。這個例子中，研究者的目標是丙氨酸和天冬氨酸。NEAA混合物，和Ala與Asp是“兼容的”，因為NEAA混合物中就包含瞭這兩種氨基酸。如果假說成立，那麼NEAA混合物就必然會出現陽性結果。而Gly和Cys就與之“不兼容”，如果假說成立，那麼就必然出現陰性結果。

簡而言之，演繹對照是為瞭說明所設定科學假說具有演繹性。其主要思想是，假如某科學假說為真，那麼在它適用的范圍內應當具有演繹性。而如果演繹出相悖的結果，那麼這個假說就不成立，或者不完整、不嚴謹（因演繹發現瞭例外，這可以反過來修正假說的限定范圍）。但話說回來，光做這樣的實驗，光設置這樣的對照，就算出現完全符合預期的實驗結果，是不能反過來證明假說的正確性。這更傾向於是證偽、而非證明的手段。否則，就犯瞭“肯定後件”的邏輯謬誤瞭。（邏輯謬誤的專欄文章傳送門：科研中慎防這十種邏輯謬誤 - 老司機的生物學課堂 - 知乎專欄）

此外，還有用於質量控制和數據標準化的內對照及外對照。

內對照是指拿樣品內自然存在的某個量化指標作為參考標準。比如說，做western blot時，我們有loading
control，它可以是整張轉印膜上的總蛋白量，也可以是某個穩定表達的管傢基因的蛋白量。像做實時定量PCR，我們也同樣有內參基因。這樣的內對照，一是可以幫助我們判斷在技術層面上實驗是否成功，二是可以拿來標準化數據。

而外對照則是將已知量的非樣品來源指標添加到樣本之中。比如說，要用質譜比較多份土壤樣品中某細菌代謝物的含量差異。由於質譜樣品的制備步驟往往較多，時間較長，難以保證每一份樣品的回收率完全一致。為瞭保證定量精確，我們可以在等重量的土壤中，摻入等量的外來物質。如此，通過計算外對照物質的回收率，就可以換算出目標檢測物的實際含量瞭。要特別指出的是，所添加的外對照，必須和實驗方案兼容（比如一定能夠被方案所設計的方法提取出來），否則就失去瞭對照的意義瞭。

最後，臨床研究還涉及標準對照，意思是絕大多數生理指標在人群中應當是一個相對穩定的值或者區間，比如血糖濃度、血壓等指標。這些“標準數值”是通過大范圍調查統計所得，因此在實際應用時可直接參考，不需再另外做實驗。