新冠疫情依舊嚴峻，筆者所在的上海小區馬上迎來瞭封控管理的第三個月，今天聊一點輔助新冠病毒研究的相關內容。

新冠病毒(SARS-CoV-2)的危險等級被世界衛生組織劃分為3級，其研究需要在BSL(biosafety level)-3，即P3實驗室進行。由於P3實驗室較高的設施和資源要求，以及活性毒株的危險性，可以在BSL-2的實驗室進行研究的假病毒就成為一種替代方案，將SARS-CoV-2用來識別人體細胞受體的 Spike（S 蛋白）錨定在慢病毒或其他逆轉錄病毒包膜表面，可形成模擬新冠病毒的假病毒，還可同時插入報告基因，更方便快捷地對病毒的感染情況或抗體對病毒的中和效果進行評估，其中VSV就是常用的一種。

水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)

野生型的VSV是一種包膜病毒，屬於彈狀病毒科，含有一條單鏈負義RNA基因組（-ssRNA），含有5種結構蛋白：核蛋白(Nucleoprotein, N)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基質蛋白(Matrix protein, M)、糖蛋白(Glycoprotein, G)和RNA聚合酶(RNA polymerase，L)。

值得一提的是，VSV為負鏈RNA(-)的病毒，其復制過程需要由(-)RNA合成(+)RNA，再由(+)RNA合成蛋白質、(-)RNA，組裝成病毒。

VSV結構蛋白示意圖

VSV感染靶細胞時，其中的G糖蛋白誘導細胞發生內吞作用，幫助病毒侵入細胞。

侵入細胞後，VSV的組裝發生在質膜上，病毒粒子從細胞表面出芽，在出芽時VSV 獲得一個包膜，該包膜包含源自質膜的脂質雙層和G 蛋白三聚體的刺突蛋白。

這一包膜過程的顯著特性之一是，VSV病毒粒子對可摻入病毒包膜的膜蛋白類型沒有特別的選擇性，當細胞與 VSV 和其他包膜病毒共感染時，VSV很容易包被其他病毒的膜蛋白。

VSV病毒粒子在沒有G糖蛋白的情況下可以出芽，再加上異源糖蛋白可以摻入VSV的性質，由此誕生瞭重組VSV病毒(rVSV)，其中糖蛋白G 的基因被報告基因取代，例如 GFP、RFP等熒光蛋白、螢光素酶或其他易於檢測的分泌酶（SEAP；分泌的人胎盤堿性磷酸酶）等，成為rVSV-ΔG，而其包膜蛋白來自待研究的異源病毒。

異源包膜蛋白假病毒的制備步驟

生產VSV假病毒主要有以下步驟（以構建新冠假病毒為例，報告基因為Fluc，luciferase）：

• 1. 使用質粒初步制備rVSV-ΔG：將編碼 rVSV 反基因組的rVSVΔG-Fluc的質粒（其G基因被Fluc取代）和四個輔助質粒(分別表達VSV N、P、G和L蛋白）共轉染至經牛痘病毒接種的表達噬菌體T7 RNA聚合酶的包裝細胞。重組VSV在包裝細胞中組裝並釋放，然後收集細胞上清獲得病毒，此時獲得的重組病毒的基因組不含有G基因，但由於G輔助質粒的表達，包膜具有G蛋白。

• 2. 擴增G蛋白補全的病毒G*ΔG-VSV：無G蛋白表達的後代VSV將無法誘導進入細胞，因此需將收集到的病毒再次侵染轉染瞭VSV-G糖蛋白表達質粒的細胞，從而擴增出更高產量的G糖蛋白補全的rVSV，即G*ΔG-VSV。

427b42fe054fae08f2b4626c5e5c7dd8G蛋白覆蓋的rVSV假病毒的制備

• 3. 使用異源病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒：構建SARS-CoV-2 S的表達質粒，轉染細胞後，全長的S蛋白可表達並錨定在細胞膜上，用以上獲得的G*ΔG-VSV侵染細胞後，提供瞭不含G基因的基因組，表達瞭除G蛋白之外的VSV的酶和結構蛋白，然後病毒出芽從細胞中釋放，即可獲得S蛋白包膜的重組假病毒rVSV-SARS-CoV-2 S，具有 SARS-CoV-2 感染的特征。

68affbb549cd3c0549bad48f803c2d60S蛋白包膜的rVSV假病毒的制備

VSV假病毒的應用

通常，可長期保存G*ΔG-VSV的毒株以及VSV-G蛋白的表達質粒，在使用時，通過質粒轉染細胞和病毒侵染，即可快速獲得假病毒。

當假病毒與含有 SARS-CoV-2 受體的細胞如Huh-7、Vero細胞一起孵育時，假病毒會通過細胞表面的受體附著並進入細胞。進入細胞的假病毒會表達除 G 以外的所有 VSV 蛋白，這些結構蛋白會被組裝成病毒包膜，包裝有缺陷的 VSV 基因組。但是，由於在這個過程中沒有表面蛋白G的表達，不能形成含有G蛋白的病毒顆粒，無法誘導細胞內吞，因此，假型病毒不能順序復制，僅具有單輪感染的能力。

VSV基因組不僅表達自身蛋白，還表達報告基因Fluc，加入底物後即可檢測。因此，可以通過檢測發光計上的發光信號來確定感染細胞中假病毒的數量。化學發光信號值與被感染的假病毒數量呈線性相關。

如果假病毒在細胞感染前與含有中和抗體或分子抑制劑的樣品共同孵育，它們將阻止細胞進入過程。阻斷病毒的數量可以通過化學發光還原的結果來確定，可反映樣品中中和抗體或分子抑制劑的水平。

異源重組假病毒的制備及宿主侵染過程

其他假病毒體系

常用的包膜病毒假病毒包裝體系除瞭VSV之外，還包括慢病毒（如HIV）載體包裝體系、鼠類白血病病毒包裝體系（MLV體系）和反向遺傳學自組裝假病毒體系等，廣泛應用於病毒的抗原學、細胞嗜性、受體識別、抗病毒抑制劑篩選、抗體血清學試驗、疫苗免疫原性中和抗體水平檢測等研究領域。

除瞭可以模擬病毒外膜結構的假病毒，還有可模擬RNA病毒核酸狀態的假病毒，提高瞭RNA病毒的穩定性，常用於RNA病毒核酸陽性對照品，用於相應病毒核酸診斷試劑提取、逆轉錄過程及檢測的質量控制。

希望假病毒技術的不斷成熟可以在新冠疫情的控制以及中和抗體的研發過程中發揮重要作用。

願上海可以早日解封，恢復正常生活！