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眾所周知,液相色譜中流動相的選擇非常重要,直接影響到色譜分離的結果。然而對於反相色譜流動相的選擇中,大傢的關註點幾乎都是在緩沖鹽的選擇上,對於有機相的選擇關註的往往很少,幾乎都是甲醇乙腈隨機使用。主要是反相液相色譜中可選的有機相種類不多,絕大多數都是甲醇,乙腈再加上少部分用四氫呋喃。而實際上,有機相的選擇也非常重要,那我們應該如何選擇,是甲醇還是乙腈,還是其他?
有機相的選擇,首先考慮的是溶劑的強度和極性。溶劑的強度決定著化合物洗脫需要有機溶劑的量,在反相色譜中隨著溶劑極性的增大而減小。我們常用的幾種有機溶劑的溶劑強度分別為:甲醇2.64,乙腈3.12,四氫呋喃4.4,從數值來看幾種有機溶劑的洗脫能力甲醇<乙腈<四氫呋喃,具體對應起來如下圖所示:
從上圖中可知,如果某一化合物能在20%乙腈水的條件下洗脫下來,如果將乙腈換成甲醇,則需約28%甲醇水才能洗脫,而換成四氫呋喃,則隻需15%的四氫呋喃就能洗脫。
Tips:上述隻是理論上的數據,在實際實驗中,如果需達到相似的保留,將乙腈更換成甲醇,我們建議在上圖的基礎上,額外增加10%甲醇;而將乙腈更換成四氫呋喃時,則需減少5%四氫呋喃。
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從三種溶劑的結構上看,甲醇在氫鍵作用下既是強的質子給予體又是強的質子接受體;乙腈具有偶極作用,在氫鍵作用下,又是非常弱的質子接受體;四氫呋喃在氫鍵作用下隻能接受質子,不能給予質子。
色譜柱:Drogon 苯基柱 150*4.6mm 5um流動相:20mM磷酸二氫鉀(pH 2.5): 有機相%(圖示)流速:1.0ml/min檢測波長:UV@220nm化合物:1. 糖精鈉 2. 對羥基苯甲酸 3. 山梨酸 4. 脫氫乙酸 5.對羥基苯甲酸甲酯
如上述實驗結果所示,在使用乙腈和甲醇分別作為洗脫溶劑的時候,出峰順序發生瞭變化。通過結構來看,糖精鈉是一個強的質子接受體,而苯甲酸是一個強的質子給予體,在甲醇做流動相的時候,甲醇既是一個強的質子接受體又是一個強的質子給予體,作用互相抵消,他們的洗脫是純粹依靠甲醇本身的洗脫能力;而乙腈隻是一個弱的質子接受體,不能給予質子,相比之下乙腈與苯甲酸之間還多瞭一層氫鍵作用,因此,苯甲酸在乙腈中的洗脫更快,導致出峰順序發生瞭變化。脫氫乙酸和對羥基苯甲酸甲酯這兩種物質,相比而言,對羥基苯甲酸甲酯帶有苯環,而乙腈中的π電子幹擾瞭它與苯基固定相的結合,因此出峰更快,出峰順序也發生瞭變化。
Tips:在用苯基柱時,使用甲醇做有機相,能更好的體現苯基的π-π選擇性。同時還可以根據目標化合物接受或給予質子的能力,挑選合適的溶劑作為流動相,能夠取得意想不到的分離效果。
除此之外,溶劑的粘度,紫外吸收截止波長也是我們選擇有機相需要考慮的內容。
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溶劑的粘度影響著儀器系統的壓力,混合溶劑粘度越大,壓力越大。上圖中列出瞭幾種常用有機溶劑與水混合時的粘度曲線,四氫呋喃與水混合的粘度曲線與甲醇類似。Tips:在使用小粒徑和小內徑的色譜柱時,更傾向於選擇乙腈作為有機相,壓力偏低。
使用紫外檢測器時,當檢測波長低於溶劑截止波長時就會生產較大幹擾。
Tips:當波長在200nm左右時,乙腈的吸收要遠低於甲醇等其他溶劑,尤其是在梯度運行的時候,使用乙腈作為流動相,基線漂移也會遠小於甲醇,這樣得到的色譜圖不僅美觀,樣品的檢測限和方法的靈敏度也要好很多。
如果你不註意防范,患上類風濕性關節炎的風險就會增加。傢裡衣物總是晾不幹,被子濕漉漉的,地板和墻面滿是水跡,空氣中還有...