一、核酸檢測的基本工作原理

*什麼是核酸？

核酸，是存在於一切動物、植物、微生物體內最基本的生命物質之一。它分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩種，都是由許多核苷酸單體聚合成的生物大分子化合物。

簡單解釋，核酸就是病毒體內的一段密碼，它可能是DNA也可能是RNA，而對於新冠病毒來說，它的密碼是RNA。

*核酸檢測的原理是什麼？

核酸檢測，通過采集人的咽拭子樣本，獲得大量人體細胞和微生物。正常情況下，所采集的樣本中會混有宿主自身的細胞、自然攜帶的細菌或病毒，甚至還有食物殘渣的細胞。患者的咽拭子樣本中，會有新冠病毒。

檢測人員通過利用PCR技術，將樣本中新冠病毒獨有的那段“密碼”放大，放大到儀器設備可以檢測的地步，從而判斷是否為陽性感染。抓取病毒遺傳物質的整個過程，就像是釣魚，魚鉤會進行識別並抓取，從而讓病毒無所遁形。

*為什麼不采用抽血的方式檢測核酸？

這主要是由新冠病毒的傳播方式和在人體的定殖增生部位所決定的。大傢知道，新冠肺炎是呼吸道傳染病，主要經呼吸道飛沫和密切接觸傳播。新冠病毒進入人體後，會在鼻咽部、下呼吸道等處“定居”並進行繁殖，成為病毒入侵的主要門戶。

因此，在病毒感染初期，如果對於疑似病例進行病毒核酸檢測，鼻咽拭子、痰液和其它下呼吸道分泌物是首選的檢測標本，這些標本獲得的陽性率也是最高的。

在已有的科學報道中，隻有在少數病例的血液樣本中可以檢測到病毒的核酸，因此血液樣本並不是新冠肺炎篩查的首選樣本類型。

*為什麼會出現“陰轉陽”的情況？

一方面主要是由於病例的個體免疫差異，與采樣的時間、病程的進展程度密切相關，少數病例在潛伏期排毒量極低，在此時進行樣本采集容易導致“假陰性”的出現。

感染者或是病人從暴露感染到開始排毒，專業上叫“強隱期”，而無癥狀感染者排毒專業上叫做“前隱期”，也可以叫實驗室檢測篩查的窗口期（指從感染病毒到能檢測出相應的抗體的這一段時間）。在窗口期期間，檢測很多次都可能檢不到陽性，但到“前隱期”末就會檢出陽性。

目前研究證實，新冠病毒在體內復制和排出體外最活躍的時間是在出現臨床癥狀前2天至發病後5天，此時咽部核酸檢測呈現陽性的可能性最大。

另一方面是因為核酸檢測是一個多環節的工作流程，包括樣本采集、運輸、滅活、分裝和檢測等環節，任何一個環節的操作不當都有可能導致“假陰性”的可能。

核酸檢測是否陽性，最主要的還是看呼吸道分泌物的排毒量。而多次檢測才出現陽性的情況，並不影響核酸檢測作為新冠病毒診斷的金標準。

*是不是每個人都需要多次核酸檢測？

多次核酸檢測才呈現陽性的病例，一般存在於少數特殊人群當中。一般是對確診病例的密切接觸者或高風險地區人群等，在常規潛伏期內，如果核酸檢測結果陰性，會考慮進行多次核酸檢測。

中國疾病預防控制中心流行病學首席專傢吳尊友此前接受央視采訪時曾說：擴大檢測范圍，盡早發現早期病人是非常有必要的，但核酸檢測沒必要每個人都反復做，檢測前應做一個風險評估，來自高風險地區、境外以及有感染人員密切接觸史的可以做。對於中低風險地區的普通人群，需要進行幾次核酸檢測，專傢會根據核酸檢測總體情況，結合確診病例、確診病例的密切接觸者、密切接觸者的密切接觸者等的分佈情況及疫情發展趨勢，進行綜合研判，提出建議。

二、核酸檢測的關鍵技術：PCR簡介

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一項利用 DNA 雙鏈復制原理，在生物體外復制特定 DNA 片段的的核酸合成技術。可在短時間內大量擴增目的 DNA 片段，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。

DNA 的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在 DNA 聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA 在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 DNA 的變性和復性，加入設計引物，DNA 聚合酶，dNTP 就可以完成特定基因的體外復制，這是 PCR 的理論基礎。

1.、反應體系

PCR 反應是在體外模擬 DNA 的復制過程，因此反應體系中必須具有 DNA 復制所需的基本要素：

模板（template），含有需要擴增的 DNA 片段。

引物（primer），一對引物決定瞭需要擴增的起始和終止位置。

聚合酶（polymerase ），DNA 聚合酶復制需要擴增的區域。

脫氧核苷三磷酸（dNTP），用於構造新的互補鏈。

緩沖液（buffer），提供適合聚合酶行使功能的化學環境。

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2、反應步驟

標準 PCR 過程分為三步：

變性（Denaturation）：利用高溫使 DNA 雙鏈分離。DNA 雙鏈之間的氫鍵在高溫下（93 - 98℃）被打斷。

退火（Annealing）：在 DNA 雙鏈分離後，降低溫度使得引物可以結合於單鏈 DNA 上。

延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降溫時結合上的引物處開始沿著 DNA 鏈合成互補鏈。延伸完成，則完成一輪循環，DNA 片段數增加一倍。往復循環這三個步驟 25-35 次，DNA 片段數將得到指數級增加。

聚合酶鏈式反應簡圖

3、結果檢測

PCR 反應擴增出瞭高的拷貝數，下一步檢測就成瞭關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為瞭主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

4、技術特點

靈敏度高

PCR 產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克（pg = 10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從 100 萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR 的靈敏度可達 3 個 RFU（空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為 3 個細菌。

特異性強

PCR 反應的特異性決定因素：引物與模板 DNA 特異正確的結合；堿基配對原則；Taq 聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。簡便、快速隻需要一次性將反應液加好後，就可以進行擴增。一般 2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗漱液、毛發、細胞、活組織等 DNA 擴增檢測。

原文鏈接：從零開始學PCR技術（一）：PCR技術簡介_簡佐義的博客的博客-CSDN博客

三、其他參考視屏

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