我們在開發HPLC方法的時候可能會遇到這樣一些化合物。方法開發過程中換瞭一圈色譜柱，嘗試瞭酸性，中型，堿性流動相，但是目標化合物仍然在色譜柱中沒有保留，在死時間沖出來。通常這些化合物極性比較大，容易電離。比如強酸性，強堿性化合物，或者一些有機鹽類。這個時候普通的流動相和色譜柱體系對這類化合物都沒有保留效果，我們需要借助離子對試劑的幫忙。

在講到離子對試劑的作用和原理之前，我們需要先梳理一下反相HPLC的分離原理。因為離子對試劑的作用原理也是建立在此基礎之上的。

反相HPLC的分離原理

反相HPLC一般通過不同化合物在固定相和流動相之間的固液分配比不同來達到分離效果。目標化合物在反相色譜體系中的保留效果取決於兩個因素：1. 色譜柱。2. 流動相。

首先我們來談談色譜柱

要想對目標化合物進行分離，首先需要確保該物質能被色譜柱的固定相保留。常用的反相色譜柱固定相有C18，C8，苯基等，這些固定相都是非極性或者弱極性的。根據同性相吸原則，非極性和弱極性的化合物更容易被色譜柱吸附（如圖1），而極性大的物質更容易被流動相帶走。

圖1

對於大多數的有機物，極性都不是很大，色譜柱對非極性和弱極性的化合物都會一定的保留能力。但是對於強極性和容易電離的化合物，非極性或者弱極性的固定相就有點力不從心瞭。強極性和容易電離的化合物很難被反相色譜柱固定相吸附和保留，而且這類化合物一般水溶性也很好，即使純水作為流動相都有可能在死時間沖出來。

接下來我們談談流動相

說到流動相pH值對化合物保留時間的影響，相信下面這張圖很多人都見過。

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圖2 流動相pH值對化合物保留的影響

這張圖對於絕大多數化合物都是適用的。通過改變流動相pH值可以抑制目標化合物電離，使目標化合物在流動相中以中性的分子形態存在。中性的分子形態極性較小，更容易被色譜柱固定相保留。但是對於一些很容易電離的化合物，即使在色譜柱允許范圍內調節流動相pH值也不能完全抑制電離，調節流動相的pH值作用不大。

對於這類化合物，我們需要需要通過添加離子對試劑給色譜柱充電，讓色譜柱固定相帶上電荷。利用電荷的異性相吸原理，吸附和保留易電離的化合物。

離子對試劑的作用原理

離子對試劑一般由可離子化的終端和烷基鏈組成。比如常見的離子對試劑，辛烷磺酸鈉的結構式如下圖。

5dd1f88aeb169b9292352f2851de4860圖3 辛烷磺酸鈉

離子對試劑是添加在流動相中的，但是其起作用的地方卻是在在色譜柱的固定相中。這裡以辛烷磺酸鈉為例子。添加在流動相中的離子對試劑隨流動相進入色譜柱，然後離子對試劑會在色譜柱的固定相和流動相之間達到平衡。

根據同性相吸的原理，辛烷磺酸鈉中的8個碳原子的碳鏈會被弱極性的色譜柱的固定相吸附，而大極性的磺酸根離子卻裸露在色譜柱的固定相外面的流動相中。吸附瞭辛烷磺酸根例子的色譜柱固定相帶上瞭負電荷，從而能吸附和保留帶正電荷的化合物（如圖4）。

圖4 填充離子對試劑的色譜柱固定相

除瞭提高色譜柱對目標化合物的保留能力，離子對試劑還有一個作用的是改善峰型。

反相色譜柱的固定相的基質主要是矽膠，矽膠表面有大量的羥基。在色譜柱制備過程中嫁接的固定相以及後期的封端工藝會消耗部分羥基，但是仍然有大量的羥基殘留在矽膠基質表面。矽膠基質表面的矽羥基和化合物相互作用會造成拖尾峰。

前面講到離子對試劑對會填充到固定相的縫隙中，這部分離子對試劑能很好的屏蔽矽膠表面殘留的羥基。從而阻止瞭目標化合物和矽膠表面的羥基相互作用，改善瞭拖尾峰。

常用的離子對試劑

作用於酸性化合物：

四丁基氫氧化銨， 四丁基氯化銨（四丁基溴化銨），十二烷基三甲基氯化銨

作用於堿性化合物：

辛烷磺酸鈉等各種烷基磺酸鹽

三氟乙酸，五氟丙酸，七氟丁酸等全氟取代的直鏈有機酸。（全氟取代的直鏈有機酸比較特殊，既是離子對實際也是調節pH的強酸）

離子對試劑的使用註意事項

離子對試劑的效果這麼好，在日常使用有事項需要註意呢？

1. 對色譜柱造成永久性的改性。大半部分離子對試劑以鹽為主，進入色譜柱的離子對試劑很難清洗幹凈。使用過離子對試劑的色譜柱換到其他流動相使用後重現型較差。一般用過使用離子對試劑的色譜柱都是專用，不建議和其他流動相混用。

2. 離子試劑體系重現性不是很好。離子對試劑本身沒有緩沖能力，對pH敏感，系統中殘留的酸和堿都會對體系造成影響。

3. 離子對試劑多為不揮發的鹽，而且很難沖洗幹凈。使用後的色譜柱容易產生離子對的鹽析出，損壞色譜柱。

4. 離子對試劑在流動相和色譜柱之間的平衡時間較長。使用之前需要對色譜柱長時間平衡，梯度方法的平衡要求比較高。

如果使用離子對試劑，建議首選揮發性的離子對試劑，比如全氟取代的直鏈有機酸。