NO.1技术起源赛思基因（http://www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 是由普渡大学Chang-Deng Hu教授在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术，填补了在活细胞内观察蛋白质相互作用的空白。赛思基因（http://www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。NO.2BiFC技术原理在GFP的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。荧光蛋白被切成两个肽段后，每个肽段不能被激发发射荧光，也不能自发组装成完整的荧光蛋白从而被激发产生荧光，但是当两个片段分别融合于相互作用的两个蛋白时，在相互作用蛋白的辅助下能重新组建成完整的荧光蛋白，从而被激发产生荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。NO.3实验材料Nicotiana benthamiana烟草农杆菌 (已转入带目的基因的载体)MES (4-morpHolineethanesulfonic acid)利福平(rifampicin)：利福平用DMSO溶解配制。LB培养基乙酰丁香酮MgCl20.5 M MES (pH 5.6)100 mM乙酰丁香酮注射器激光共聚焦显微镜普通离心机溶液配方：0.5 M MES (pH 5.6)：称取9.75 g 无水MES用去离子水溶解，用NaOH调pH至5.6，定容至100 ml，过滤灭菌后于4 °C保存。100 mM乙酰丁香酮：称取196.2 mg乙酰丁香酮，用5ml DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再加去离子水定容至10 ml，过滤灭菌后于-20 °C保存。NO.4实验步骤种植Nicotiana benthamiana烟草。在14 h光照/10 h黑暗，温度25 °C，相对湿度70%条件下培养大概4～5周。将含有目地基因的载体转入农杆菌中。注：GV3101、EHA105、LBA4404这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化。在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如GV3101还需要添加50 μg/ml的利福平。挑取含有目的载体的农杆菌单克隆至含有相应抗生素的5 ml LB培养基中，在28 °C，200 rpm的条件下培养2 d。(新鲜转化的农杆菌单克隆在3 ml培养基培养过夜至 1 d即可)转移1 ml培养的农杆菌菌液至20 ml含有相应抗生素的LB培养基中扩大培养，该LB培养基含15 μM乙酰丁香酮。在28 °C，200 rpm的条件下培养至农杆菌生长的对数期(OD600 = 0.5-0.6)。在室温，5,000 rpm离心10 min以收集菌体，用浸染液(含10 mM MgCl2, 10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH = 5.6)悬浮农杆菌菌体至OD600 = 1.0。室温静止2～3 h (至少0.5 h，至多不超过3 h。)等体积混合两种含有不同质粒的菌体，用1 ml的针头在烟草叶片背面轻轻点开一个小口 (注意不要刺穿)，再用去掉针头的针管吸取菌液，从叶片伤口处注射到叶片中。用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。(图1)注射过的植株于21 °C左右培养2 d后观察烟草注射农杆菌的区域有无荧光。撕取烟草叶片标记区域 (可以不撕，直接用刀挖出靠近伤口的叶片部分即可) 用激光共聚焦显微镜进行荧光的成像 (叶片背面表皮细胞层较好观察)。(图1)

图1. 农杆菌注射烟草叶片NO.5注意事项选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，幼嫩或皱缩叶片不易注射，衰老叶片的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射。农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的一个参数，OD600 = 1.0并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。不同外源基因的瞬时表达效率大不相同——这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10次只能表达出一两次，建议在BiFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。注射后的植株通常在2 d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等。NO.6BiFC实验常见问题及解决方法1、荧光信号较弱原因：蛋白空间位阻所导致的片段间不能相互靠近。对策：荧光片段和目标蛋白之间最好加一个连接肽。常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT,RPACKIPNDLKQKVMNH和GGGGS等2、实验温度不当原因：温度对片段间互补影响很大对策1：在室温或低于室温（≤）下培养细菌或细胞对策2：在生理条件下培养细菌或细胞，使融合蛋白正常表达，然后将培养物低温处理1至2h或接着室温培养1d3、不能明确蛋白之间的相互反应原因：没有明确的阴性对照对策：建立阴性对照。以便更加确信BiFC信号反映的是蛋白质之间的相互作用NO.7BiFC技术优缺点优点：1、适用于体内和体外蛋白相互作用的研究2、在细菌，真菌以及真核细胞中检测时，所研究的蛋白处于天然环境中并且能直观报道蛋白相互作用在细胞中的定位研究3、BiFC技术耗时较短4、BiFC只需要荧光倒置显微镜，数据处理简单，只是检测荧光的有无，背景干净，检测更加灵敏，不依赖于其他次级效应5、BiFC技术还可以用于研究蛋白之间的弱相互作用或瞬间相互作用，不需要蛋白有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白间的相互作用缺点：1、对系统温度敏感，一般在30℃以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段的互补，这对细胞在生理条件下的蛋白相互作用带来不利因素2、观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白的相互作用过程，不能实时观察，蛋白相互作用或蛋白复合物的形成过程NO.8应用举例

Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) together with ECFP. JunΔL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Student’s t test, p<0.05.NO.9参考文献1. Yuan, M. and Xu, C. Y. (2018). BiFC Assay for Detecting Protein-protein Interaction in Tobacco Leaves. Bio-101: e1010133. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010133.2. Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 2002 Apr;9(4):789-98. doi: 10.1016/s1097-2765(02)00496-3. PMID: 11983170.

赛思基因（http://www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。