分子生物学最初的中心法则认为，DNA转录成RNA，然后再由RNA翻译成蛋白质。但在上世纪70年代，随着两支科研团队（分别为威斯康星大学的Howard Temin领导的团队和麻省理工大学David Baltimore领导的团队）各地独立发现了与RNA病毒（逆转录酶病毒）复制相关的新酶，这一理论遇到了挑战 。这些酶可以将病毒RNA基因组转换成互补DNA (cDNA)分子，随后即可整合到宿主的基因组中。这些酶为RNA依赖性DNA聚合酶，又称逆转录酶。因为它们与核心理论的DNA到RNA流程不同，而是由RNA模板转录成cDNA分子（图1)。1975年，Temin 和 Baltimore凭借在发现逆转录酶方面的创举，获得诺贝尔生理学或医学奖（与Renato Dulbecco共同获得，后者凭借在诱导肿瘤病毒方面的成果获奖）。

图1，中心法则

逆转录酶的应用

（一）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

在RT-PCR中，通过逆转录（RT）将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增cDNA（图2）。利用cDNA扩增步骤，有望对初始RNA进行进一步研究，即便RNA样本数量有限或低丰度表达。RT-PCR的常见应用包括表达基因检测、转录物变异检测，以及克隆和测序用cDNA模板制备。

由于逆转录可为PCR扩增和下游实验提供cDNA模板，因此，它是实验成功的关键步骤之一。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率，即便是难转录RNA样本，如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的RNA样本。

图2，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT=逆转录，RTase=逆转录酶

一步法和两步法是两种最常用的RT-PCR方法，每种方法都具有各自的优缺点（图3）。顾名思义，一步法RT-PCR在单个反应管中将第一链cDNA合成（RT）和后续PCR反应结合在一起。该反应设置可简化工作流程、减少结果差异，并将污染的可能性降至最低。一步法RT-PCR简化了大量样本的处理，适用于高通量应用。但是，一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增，将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆转录和扩增条件，因此，一步法RT-PCR在某些情况下可能具有较低的灵敏度和效率。但是，在RT-PCR中使用基因特异性引物，有助于最大化目标cDNA的得率，并最小化扩增背景。

图3，一步法和两步法RT-PCR的比较

两步法RT-PCR包含两个独立反应，首先进行第一链cDNA合成（RT），然后在单个反应管中通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。因此，两步法RT-PCR可用于检测单个RNA样本中的多个基因。RT和PCR反应独立进行，可对每个步骤的反应条件进行优化，使逆转录引物选择（oligo（dT）引物、随机六聚体或基因特异性引物）和PCR反应建立（如DNA聚合酶选择和PCR组分）更灵活。与一步法RT-PCR相比，两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤以及提高污染和结果变异的可能性。

表1，对比一步法和两步法RT-PCR

（二）定量RT-PCR（RT-qPCR)

荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）的最常见应用之一是通过对细胞和组织经过一些处理（如药物治疗）后对体内特定DNA序列进行定量分析。与RT-PCR工作流程相似，RT-qPCR首先将RNA转化为cDNA，然后进行PCR扩增。主要区别在于，RT-qPCR通过荧光法测定扩增cDNA的水平（图4）。

图4，定量RT-PCR（RT-qPCR)

RT-qPCR基因表达定量的准确性在很大程度上取决于cDNA模板的质量和数量。因此，逆转录对于RT-qPCR的成功至关重要。逆转录步骤应产生可代表初始RNA的cDNA产物。因此，所选择的逆转录酶应该具有有效合成cDNA的能力，即使是对低丰度基因、次优质和难转录RNA样本（即富含GC、存在抑制剂或降解RNA样本）。

除高效逆转录酶之外，在选择逆转录反应试剂方面还需要考虑很多因素。首先，在宽的RNA起始量范围内，cDNA的动态范围或线性扩增是至关重要的。使cDNA得率与RNA起始量成正比，可确保基因表达定量的准确性。

此外，所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的cDNA得率，以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果。单管预混液含有逆转录所需的所有必需组分，有助于将实验变异、交叉污染和移液误差降至最低。

（三）cDNA克隆和文库构建

逆转录酶在分子生物学中的首要应用之一是构建cDNA文库。cDNA文库由可代表特定样本中转录序列的cDNA克隆组成。因此，文库提供了关于特定细胞类型、器官或发育阶段的基因时空表达信息。cDNA文库克隆可用于鉴定新型RNA转录物、测定基因序列和重组蛋白的表达。

构建cDNA文库的必要条件是RNA可适当代表其全长和/或相对丰度，因此，逆转录酶的选择非常重要。具有高持续合成能力的逆转录酶可以合成长cDNA，并捕获低丰度RNA。同样，在对具有高度二级结构的RNA进行逆转录时，建议使用热稳定性较强的逆转录酶。

（四）cDNA末端快速扩增（RACE）

cDNA末端快速扩增（RACE）是一种基于PCR的方法，可用于确定cDNA 5'和3'末端的未知序列。通常，这些方法分别被称为5' RACE和3' RACE。RACE的实验目标包括鉴定5'和3'非翻译区、研究异质性转录起始位点、表征启动子区域、测定完整cDNA序列以及用于蛋白质表达的完整开放阅读框（ORF）的测序。

起始RNA的质量和逆转录反应的设置对于成功完成RACE实验至关重要。在5'RACE中，任何长度的（甚至包括未到达mRNA 5'末端的）第一链cDNA都将具有添加序列（即同聚物尾部结构或接头），随后通过PCR进行扩增。为了最大化全长cDNA的合成，应选择具有最小RNA酶H活性、高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。

（五）RNA测序（RNA-Seq）

RNA测序，又称为RNA-Seq，通常可用于研究从基因组转录的RNA及其调控作用。随着二代测序（NGS）的出现，RNA-Seq已经成为用于分析全转录组（即转录的编码和长非编码RNA）、测定基因表达、发现剪接变异和融合转录物以及检测低丰度基因的的高通量方法。与基因芯片相比，RNA-Seq的优点包括动态范围更大、灵敏度更高以及可在无基因组信息的情况下表征RNA序列。

由于大多数测序平台是为DNA设计的，因此，RNA-Seq模板制备需要进行逆转录。最好的结果是所得cDNA能够无偏差代表初始RNA，包括低丰度转录物。全长cDNA合成对于捕获样本中的所有RNA序列也很重要。逆转录的错误率非常关键，其取决于序列文库的大小和数据质量。因此，应认真选择逆转录酶。

（六）基因表达芯片

在20世纪90年代，DNA芯片的发展开辟了大规模无偏差或先前假说的基因表达图谱分析。芯片由玻璃或矽晶片上数千个被称为“features”或“spots”的腔室组成。每个腔室的表面上固定有相同拷贝数的单链DNA序列，称为“探针”，每个探针代表一个基因。探针与用于微阵列的荧光标记cDNA靶标杂交，可同时比较两个样本之间的基因表达。

在选择逆转录酶以制备用于基因芯片实验的cDNA靶标时，获得高产量全长cDNA的能力对于良好覆蓋RNA来说至关重要，包括富含GC或具有二级结构的RNA序列。同样重要的是，为确保获得高信噪比，逆转录酶必须能够有效整合修饰的核苷酸，从而能够准确且无偏差地检测输起始RNA。

注：本文节选自赛默飞官网，旨在分享知识。

下期内容：逆转录酶的性质，敬请期待！