撰文丨小白薯

責編 | 子 信

目前已經發現在RNA中有超過100種的化學修飾 【1】。最近發現一些在mRNA上的修飾，如m6A甲基化，拓寬瞭對表觀轉錄組學（epitranscriptomics）的認識。在所有的這些修飾中，m6A可以說是RNA epitranscriptomics領域的一顆新星。通過測序數據分析，m6A修飾是在mRNA和非編碼RNA（ncRNA）中是最豐富的一種。m6A修飾主要集中在一個含RRACH的保守motif中出現，而且在mRNA的3’ UTR和轉錄起始位點（transcription start site, TSS）豐度最高【2-3】。

m6A影響的功能非常之廣泛。在分子水平，m6A幾乎影響到所有方面的mRNA的代謝，包括剪接、翻譯、穩定性以及miRNA的成熟【4-6】。這些被m6A調節的RNA代謝過程在這一系列的細胞進程中扮演著重要角色。在細胞水平，它可以影響免疫細胞的穩態、精細胞的發育、造血幹細胞的造血功能、癌細胞的發生、神經細胞的發育等等。近些年來，據不完全統計，有關它的功能的報道已經有不下200篇高水平的文章。即使現今，它的火熱程度也是有增無減，不斷有高水平文章更新。

盡管m6A近些年來如此火熱，但其實m6A的發現都已經有將近半個世紀的歷史瞭。早在1974年，m6A就已經被發現存在於癌細胞中【7】。後來陸續發現在病毒/酵母/植物/動物等物種中大量存在【8-11】。m6A首次被鑒定存在於一個保守的含RRACH的motif中是在上世紀八十年代，科學傢利用當時的測序技術和生化分析手段得出該結論，並且該結論近年來被現在高通量的二代測序分析所證實 【2、3、12、13】。（不得不由衷的佩服當時的科學傢的水平和能力，也感慨一下那時候國內的科研基礎與國外的的科研實力的差距！）

在體內，m6A修飾主要被三類蛋白分子調節，催化在RNA上形成甲基化的酶一般稱為“編碼器”（writer，m6A甲基轉移酶），去除在RNA上甲基化的酶被稱為“消碼器”（eraser，m6A去甲基化酶），識別RNA上甲基化的酶被稱為“讀碼器”（reader，m6A結合蛋白或識別蛋白） [圖1]。因此，m6A甲基化修飾是個可逆的動態過程，分別由編碼器寫入和消碼器消除，並且還可以通過讀碼器識別，參與並影響到一系列的生物學過程。

圖1. m6A甲基化動態過程（Curr Opin Struct Biol. 2017）

在今天的介紹中，我們主要簡述m6A結構生物學的進展，即，從結構生物學的角度，描述關於m6A “編碼器”、“消碼器”和“讀碼器”最新研究進展。說到m6A的結構生物學進展，不得不提及最近的三篇關於m6A的結構生物學文獻綜述 【14-16】，均是有華人科學傢撰寫，甚感欣慰！準備此文，主要參考瞭這三篇綜述和其他主要的原始研究性論文。（其實在m6A領域，如今的華人科學傢可以說是占據半壁江山，其中的開拓者之一Chuan He更是不得不提及的大牛！）

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下面正式進入今天的主題。

m6A “編碼器”

m6A “編碼器”發現簡史

如今越來越多的蛋白質被鑒定為m6A “編碼器”蛋白復合物組分，目前已經報道的包括METTL3、METTL4、WTAP、KIAA1429（VIRMA/Virilizer）、RBM15、RM15B、HAKAI等蛋白【4、5、15】。另外需要註意的是，另一個單獨的m6A甲基轉移酶METTL16被報道為專一的催化pre-mRNA和non-coding RNA 【17-18】，暫時沒有發現它需要與其他蛋白形成復合物才能執行功能。關於METTL16此處不多做介紹。

m6A “編碼器”蛋白的發現可謂曲折。早在上世紀90年代，Rottman課題組就在開展相關的研究。他們直接從內源細胞提取蛋白，鑒定出三個甲基轉移酶的組分：MT-A1、MT-A2和MT-B 【圖2】。這MT-A1僅含30 kDa的蛋白，後續實驗的重復性也並不是很好，具體是什麼組分作者沒有鑒定，我們無從考證，後來作者自己也放棄瞭 【19-20】。然而另外兩個組分分別含有一個200kDa和875kDa的復合物。並且，最關鍵的是，作者從這個200kDa復合物中分離出瞭一個SAM（甲基供體）結合的70kDa的蛋白，命名為MT-A70。通過蛋白酶解、HPLC分離和蛋白質測序，該課題組最終確定瞭該蛋白質的序列（筆者再次佩服當時國外的科研水平和這些科學傢的能力，硬生生的把一個未知蛋白找到並且還確定瞭它的DNA和蛋白質序列，對這些科學傢表示深深的敬仰之情！）。後來的人類基因組計劃測序完人類基因後，Human Genome Orgnisation (HUGO) Gene Nomenclature Committee將該基因命名為METTL3【21】，與Rottman的發現完全一致。

圖2. 內源蛋白的提取（RNA, 1997）

2008年，METTL3的同源蛋白AtMTA在擬南芥中的功能被報道，AtMTA的紊亂會導致球胚期胚胎發育的不正常。同時，AtMTA被鑒定與另一個蛋白AtFip37（即在哺乳動物中WTAP的同源蛋白）相互作用【10】。

時間來到2014年，有四個課題組獨立報道瞭METTL3-METTL14的相互作用關系 【22-25】。其中Chuan He組，Jing Crystal Zhao組和Yungui Yang組稍早於Aviv Regev組。他們都分別獨立地鑒定出METTL3、METTL14是m6A “編碼器”蛋白復合物的重要組分，並且鑒定兩者之間的相互作用。有意思的是，He和Zhao在測定甲基化活性實驗發現，METTL3、METTL14對於甲基化活性有一個協同效應，即單獨的METTL3，METTL14對於METTL3-METTL14二元復合物的活性有極大的促進作用。在他們的體系中，METTL3是沒有甲基轉移酶活性的，但是METTL14的活性卻是相當可觀的 【圖3】。這一點使值得商榷的，我們後面會討論到。

圖3.甲基化活性探索結果（Nat Chem Biol. 2014）

在He，Yang和Regev的發現中，WTAP被報道是m6A “編碼器”蛋白復合物的另一個重要組分。它的存在不影響甲基化活性，但是可能影響結合RNA的能力。也被推測WTAP可能在m6A時空性調控中其重要作用。盡管Regev的報道是最晚的，不過他的內容最豐富。除瞭METTL3、METTL14、WTAP外，他們還鑒定到另一個蛋白組分KIAA429。該蛋白此前被報道與WTAP相互作用，但是與m6A的關系還是首次被提及。後來越來越多的實驗也證明瞭KIAA1429在m6A “編碼器”蛋白復合物的重要角色。由於本文主要關註m6A結構生物學進展，所以也就不過多討論WTAP、KIAA1429、RBM15等蛋白的發現和功能瞭，而目前除瞭METTL3-METTL14有結構外，其他的“編碼器”蛋白還沒有與m6A相關的蛋白結構。

m6A “編碼器”結構基礎

自從METTL3-METTL14復合物被鑒定之後，它的結構生物學基礎就一直比較受大傢關註。2016年，三個課題組分別獨立的報道瞭METTL3-METTL14復合物甲基轉移結構域（methyltransferase domain，MTD）的晶體結構 [26-28] ，其中就有來自國內的科學傢。華中農業大學的殷平課題組和中科院武漢物理與數學研究所唐淳研究員的合作，率先在Nature雜志報道瞭METTL3-METTL14 MTD的晶體結構。從晶體結構上看，METTL3 與METTL14的結構相似性很高，並且二者有很強的相互作用。METTL3包含甲基供體（SAM）的結合口袋，但是METTL14的相應位置卻是個退化的SAM結合位點，不能結合供體SAM或產物SAH（這個猜想在此前的一篇生物信息學結構預測文章中有所提及，不過，最終還是眼見為實）。

通過進一步的生化方法，證明瞭METTL14並沒有甲基化活性，這一點與之前初期開始鑒定METTL3/METTL14時有一定的矛盾。不過這一觀點也得到瞭比較好的解釋。Nam課題組推測，由於初期鑒定時，He和Zhao都是用的哺乳動物細胞系，提純的蛋白並不純，尤其是METTL14在表達的過程中，很可能也很容易污染內源的METTL3。這一觀點在Nam的文章中有所證實，單獨從哺乳動物細胞中純化METTL14，可以通過western檢測到METTL3的存在。其實我們回過頭去仔細看Zhao的文章的蛋白膠圖，在原文figure 1e的western膠圖中，其中純化的METTL14的western結果有是有明顯的METTL3的陽性條帶的。同時，純化的METTL3的western結果也有較弱的METTL14的陽性條帶 [23] 【圖4】。這是為什麼呢？為什麼METTL14容易被METTL3污染呢？這一點也可以通過結構的角度得到解釋，晶體結構表明METTL14和METTL3存在非常大的相互作用界面，有超過20氨基酸參與瞭他們兩者之間的相互作用，說明他們的相互作用的確使很強的 [26, 27]。另外，筆者瞭解到，單獨的METTL14蛋白並不是很穩定，METTL3可以幫助其不容易被降解。因此，METTL14在哺乳動物細胞系表達和純化過程中很容易被內源METTL3污染。

圖4. Zhao’ Lab 文章中METTL3/METTL14 western實驗結果（Nat Cell Biol. 2014）

最終的METTL3-METTL14的復合物結構呈現出一個蝴蝶狀，都是非常經典的Rossman fold甲基轉移酶結構域 【圖5】。它的新穎之處在於它是兩個同源蛋白形成的二元復合物，一個是真正的甲基轉移酶，另一個起到平臺和輔助的作用 [26, 27]，這在甲基轉移酶的研究中是比較少見的。從該結構可以看出m6A甲基轉移酶既是一類保守的甲基轉移酶，同時又是以一種與眾不同的方式執行著甲基化的功能。比較遺憾的是，當時的晶體結構解析的METTL3-METTL14並沒有甲基轉移酶的催化活性，原因在於該晶體結構僅包含甲基轉移酶結構域。殊不知，在“真”酶METTL3的MTD結構域前面，還有兩個串聯的CCCH類型的鋅指結構域 [29]。生化結果表明，沒有這兩個鋅指結構域，該甲基化復合物的活性就會完全缺失，表明這兩個鋅指結構域的作用非常重要 [27]。殷平課題組與唐淳課題組繼續合作，證明在鋅指結構域（Zinc finger domain，ZFD）與甲基轉移結構域（MTD）之間是一段的lingker非常柔性，這也可能可以一定程度上解釋為什麼之前的晶體結構中看不到ZFD結構域 [30]。

圖5. METTL3-METTL14復合物結構

殷平教授早年在施一公老師實驗室一直從事結構生物學研究，晶體對他來說是絕對的優勢。唐淳研究員一直從事核磁共振（NMR）技術和方法的開發，一直是該領域的知名專傢，早年也被選為HHMI國際青年學者。所以該課題組對於解決小蛋白的溶液結構應該是駕輕就熟。Yin和Tang兩組合作，用NMR的方法，解析瞭ZFD的溶液結構（據悉，他們也嘗試過用結晶的方法去解析單獨的ZFD的結構，但是一直都沒有成功長出）。並且通過蛋白連接實驗證明該溶液下，單獨的ZFD與ZFD-MTD復合物中的ZFD，是沒有顯著區別的。並且通過蛋白連接得到的ZFD-MTD的蛋白活性與生型區別不明顯。由此，ZFD的結構解決瞭。ITC實驗表明，ZFD與底物RNA的相互作用非常微弱，僅能在低溫10℃條件下滴到20幾個微摩爾的KD。結構及其他的生化實驗表明，ZFD可能起著一個Target recognition domain（TRD）的作用（基本上否定瞭此前在Nature報道的METTL14可能起到TRD的作用的假設），並且在ZFD上的一些堿性氨基酸和疏水性氨基酸主要參與和RNA相互作用 [30]。

ZFD和MTD的結構的解析並不意味著它的結構生物學研究就差不多結束瞭。相反，它才剛剛開始。還有眾多的問題等待著結構生物學的進一步研究。例如，該甲基復合物具體是如何識別底物RNA的，我們所熟知的m6A底物都含有非常保守的RRACH motif，具體他是如何被“編碼器”蛋白識別的呢？是否RNA上每一個RRACH motif都會被“編碼器”蛋白催化呢？如此龐大的“編碼器”蛋白復合物是如何在體內調控生理過程的呢？是否存在時空表達的調控問題，等等，都值得結構生物學的進一步研究探討。

m6A “消碼器”

m6A “消碼器”發現簡史及結構基礎

目前為止，m6A去甲基化酶--“消碼器”蛋白存在兩類：FTO和ALKBH5。他們兩個分別以不同的方式行使著去甲基化的功能。FTO將m6A消除需要通過兩步反應，先將m6A轉化為hm6A（N6-hydroxymethyladenosine），轉化成N6-formyladenosine (fm6A)，最後再變成A [31]；而ALKBH5則直接將m6A的甲基去掉，形成A [32] 【圖1】。

關於這兩個蛋白，目前爭議最大的是FTO，因為2017年Samie R. Jaffrey組發在Nature上的一篇文章，把它推向瞭質疑的風口浪尖。該文章指出，FTO在體內的真正催化底物不是m6A，而是m6Am [33]。“一石激起千層浪”，該課題組的與Chuan He算是從此“杠”上瞭。由於賈桂芳老師和He Chuan老師是FTO作為m6A“消碼器”蛋白的提出者和鑒定者，所以面對質疑，他們實驗室重復瞭該實驗。筆者聽過賈桂芳老師和何川老師的報告，他們的結果重新質疑瞭Samie R. Jaffrey的結果，他們認為Samie R. Jaffrey的對照有問題。因此他們堅持認為FTO在體內的催化底物依然是m6A，而不是m6Am（真的搞錯瞭嗎？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解讀丨特別推薦）。他們都專門強調瞭他們的實驗結果，其中He老師還在2017年的蘇州冷泉港RNA修飾專題會議上公開瞭他們的實驗結果，以回應Samie R. Jaffrey的質疑。

Anyway，不管其中的質疑如何，科學總是在不斷的質疑中前進，每一個小小的進步都是在前人的成功中總結經驗，從失敗中吸取教訓！我們還是暫且將FTO歸為m6A“消碼器”蛋白來討論。剩下的質疑，交給時間去檢驗。

FTO的蛋白結構解析是在發現催化m6A功能之前。早在2010年，清華大學柴繼傑老師課題組就報道瞭FTO的晶體結構與另一底物3-meT的結構 [34]。從序列上看，FTO與DNA m5C修飾去甲基化酶TET同屬於2-oxoglutarate (2OG)-dependent oxygenase傢族。從結構上看，FTO有兩個完整的結構域：N-端結構域（NTD）和C-結構域（CTD）【圖6】。其中NTD是與2-oxoglutarate (2OG)-dependent oxygenase傢族的結構和序列保守，CTD主要起到一個骨架的支撐作用。

圖6. FTO的結構（Genomics Proteomics Bioinformatics. 2018）

早期解析FTO的結構主要是因為FTO是作為肥胖相關基因的重要性[35]。直到2011年，Chuan He組在Nature Chemical Biology發表瞭FTO作為RNA m6A的去甲基化酶的研究論文（Yuigui Yang也有合作），第一次闡明瞭m6A修飾的RNA是FTO在體內的生理底物 [36]。之後陸續有大量文章報道對FTO基因的調控會使體內的m6A水平受到顯著的影響 [5, 37, 38]。

也正是與肥胖的關系，在FTO結構解析後，有不少課題組對此蛋白做瞭不少的藥物篩選，其中就包括國內武漢大學的周翔課題組和上海藥物所的楊財廣課題組的工作（據悉，楊財廣老師在2004-2008年期間在Chuan He老師組做博士後）[39-42]。然而直到2017年Samie R. Jaffrey的Nature報道FTO的生理底物可能是m6Am而不是m6A [33]，才讓人對該蛋白產生瞭質疑。目前也確實有不少文章對此表示過探討和猜測，由於FTO與底物m6A的復合物的缺乏，更讓人對此產生瞭一定的懷疑—為什麼FTO可以長出與3meT的晶體，卻至今沒有人報道與m6A的共結晶，是因為這個原因嗎？我們不得而知，最終結果與結論需要進一步的研究。反正神仙打架，凡人避讓！

在鑒定瞭FTO作為“消碼器”蛋白之後，Chuan He組繼續和Yungui Yang 組合作，堅定瞭另一個m6A“消碼器”蛋白--ALKBH5 [32]。Alkb蛋白也是屬於2-oxoglutarate (2OG)-dependent oxygenase大傢族中，Alkb蛋白在哺乳動物中有8個同源蛋白（算上FTO的話是9個），分別都有不同的催化底物。

ALKBH5蛋白發現後，結構很快就被解析出來 【圖7】。2014年，有四個獨立課題組解析瞭ALKBH5的蛋白結構 [43-46]。其中包括中國農業大學的陳忠周老師、多倫多大學的Jingrong Min組和Chuan He組。比較有意思的是，最早online的結構是在2014年1月份，英國牛津的McDonough教授發表在NAR雜志。而Chuan He老師組解瞭一個斑馬魚的一個同源蛋白，發在FEBS Letter雜志上，明顯是被前者scoop瞭。你可以想象一下，一個自己課題組鑒定功能的的蛋白竟然被別的做結構的課題組搶發瞭結構，說說也是有些可笑！不過這也可以從側面反應結構生物學的競爭是有多激烈，以及m6A確實是有多火熱！不過話說回來，Chuan He老師組當年已經多年不做結構瞭，可能一下子上手有些生疏瞭，就比別人慢瞭一步瞭，哈哈！（開玩笑的！）

圖7. ALKBH5的結構（Genomics Proteomics Bioinformatics. 2018）

ALKBH5的結構特征其實與其他2-oxoglutarate (2OG)-dependent oxygenase傢族的蛋白相似，包括FTO的NTD。這兩者都是典型的“卷筒蛋糕狀”（jellyroll fold）構型。催化中心有一個保守的HXD..H motif (組氨酸/天冬氨酸/組氨酸模體)構成。比較有意思的是，這兩者的結構都與該傢族另一蛋白ABH2的結構非常相似 [15]。而ABH2的催化底物是雙鏈的DNA而不是RNA，這也許可以通過結構比對，從結構的角度去解釋ABH2與FTO和ALKBH5的差別。通過結構比對，正好在ABH2結合雙鏈DNA的位置，FTO和ALKBH5分別有一個額外的loop阻礙瞭與DNA的結合，使得它們僅能催化單鏈的DNA或RNA（ALKBH5也有催化單鏈DNA的活性），盡管他們阻礙結合dsDNA的loop在位置上並不一樣，但是達到的效果是一致的 [15] 【圖6和圖7】。遺憾的是，目前為止，均沒有ALKBH5和FTO與m6A RNA底物的共晶結構，這使得其中的分子機制還是若隱若現，目前對於m6Am作為的FTO底物的猜測，也可能隻有等待結構生物學的解決才能最終闡明其中的分子機制。我們期待更大的突破！

m6A “讀碼器”

m6A “讀碼器”簡史

YTH domain傢族被鑒定為m6A“讀碼器”蛋白是不可爭辯的 [16]。在哺乳動物中，YTH domain傢族共有五個成員，分別是：YTHDF1、YTHDF2、 YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2 [14-16] 【圖8】。YTH domain最早被鑒定是在2002年，當時僅僅被作為普通的RNA結合蛋白 [47]。它第一次與m6A關聯是在2012年。2012年，在Nature和Cell雜志幾乎同時online瞭兩篇測序相關的文章，拉開瞭近幾年來m6A的功能研究的序幕 [2, 3]！在Nature的文章中，不僅報道瞭m6A在高等哺乳動物中的豐度，還鑒定瞭一組RNA結合蛋白，其中就包括YTHDF2和YTHDF3。

圖8. YTH傢族的蛋白序列（Genomics Proteomics Bioinformatics. 2018）

YTH蛋白真正被公認作為m6A“讀碼器”蛋白是在2013年底Chuan He組的Nature報道中 [48]。他們鑒定瞭YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3作為m6A“讀碼器”蛋白的重要角色。後來相繼報道瞭YTH domain傢族的其他幾個蛋白，並且一一被鑒定為RNA m6A的“讀碼器”蛋白 [49-51]。值得推崇的是，Chuan He組幾乎參與瞭每一個YTH傢族蛋白的開創性鑒定工作。（實際上不僅是m6A“讀碼器”蛋白，幾大主要的m6A“編碼器”和 “消碼器”蛋白的鑒定工作也是如此！m6A領域相關的三大類蛋白的絕大部分的開創性工作都有Chuan He老師的貢獻，真不愧是m6A領域的巨牛、開拓者和奠基人！）

在這五個YTH domain蛋白傢族中，YTHDC1是唯一定位在細胞核中蛋白，主要參與調節mRNA的剪接和非編碼RNA介導的基因沉默，影響RNA出核等功能 [52-54]。其他四個都在細胞質中發揮功能。YTHDF2主要通過與CCR4-NOT復合物相互作用，影響RNA的穩定性，促進RNA的降解 [55]。YTHDF1、YTHDF3和YTHDC2則可以影響mRNA的翻譯效率 [14-16]。需要強調的是，YHTDC2包含1400多個氨基酸，除瞭YTH domain外，還有其他多個不同功能的結構域。因此，它也是最晚才被鑒定的。作為m6A“讀碼器”，YHTDC2被報道在哺乳動物的睪丸組織中高度特異表達，並且與減數分裂特異性蛋白MEIOC相互作用 [50, 51]。因此，它在精子發生中起著重要作用。扯遠瞭，回到m6A“讀碼器”的結構生物學進展。

m6A “讀碼器”結構生物學基礎

2014年，共有五個獨立課題組報道瞭YTH domain的結構 【圖9】。在當年的九月份，YTH傢族的第一個結構是Jinrong Min和Chuan He合作在Nature Chemical Biology報道瞭人源的YTHDC1與修飾的RNA—GG[m6A]CU的復合物結構 [49]。該文章從結構生物學的角度第一次解釋瞭YTHDC1識別m6A修飾的RNA的分子機制。幾乎同時，YTH domain在Zygosaccharomyces rouxii酵母中的同源蛋白MRB1與m6A修飾的RNA復合物也被報道在PNAS雜志上 [56]。緊接著在11月份，在Nucleic Acids Research和Cell Research雜志也online瞭關於YTH蛋白的三篇文章 [57-59]。其中NAR雜志報道的是鼠源YTHDC1的溶液結構，該結構也包含m6A修飾的RNA底物 [57]。在Cell Research雜志同時online的兩篇文章分別是是中科大施蘊渝院士和復旦大學徐彥輝博士課題組的工作。其中施老師課題組報道的是YTHDF2與m6A核苷酸的復合物結構 [59]；徐老師課題組報道的是YTHDF2單獨的結構 [58]。隨後的2015年，Jinrong Min課題組繼續在該領域做瞭不少工作。人源的YTHDF1與酵母的同源蛋白Pho92與RNA的復合物結構被解析出來 [60]。

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圖9. YTH domain的識別m6A結構基礎（Genomics Proteomics Bioinformatics. 2018）

對於YTH domain識別m6A的分子機制，通過結構生物學得到瞭非常完善的闡述。YTH domain通過幾個保守的芳香族氨基酸 (W377, W428,and L439 in YTHDC1; W411, W465, and W470 in YTHDF1; W432, W486, and W491 in YTHDF2; and W200, W254, and Y260 in ZrMRB1)，形成一個巧妙的籠子，這個籠子正好可以“關住”腺嘌呤上被修飾的甲基基團—甲基化的腺嘌呤可以通過嘌呤堿基和苯環之間π-π相互作用，以及甲基基團與芳香族氨基酸的cation-π相互作用被YTH識別；當腺嘌呤沒有被修飾時，YTH domain就缺少瞭“卡住”目的RNA的甲基基團，於是與RNA的相互作用力就會減弱[14-16] 【圖9】。這個特異性識別m6A修飾的RNA結合蛋白很好的詮釋瞭m6A“讀碼器”的作用。不僅如此，YTH domain上的一些氨基酸還可以與RNA上的其他堿基的相互作用，比如在YTH蛋白的識別過程中，YTHDC1更偏好在RNA的-1位置（甲基化的A為0號位）是G而不是A，因為G可以與蛋白上的V382形成氫鍵相互作用。RNA其他位置對於二者之間的相互作用來說也有一定的選擇性，主要是氫鍵、電荷相互作用等作用力在其中起主要作用。這些結構的解析揭示瞭YTH domain傢族蛋白作為m6A“讀碼器”的真正分子機制 [15, 49]。

有意思的是，包含YTH domain的蛋白並不一定就是m6A的“讀碼器”。施蘊渝老師和復旦大學麻錦彪老師課題組分別報道瞭Schizosaccharomyces pombe的meiotic mRNA interception protein 1 (Mmi1)蛋白與RNA的復合物結構 [61, 62]。Mmi1蛋白是與減數分裂相關的蛋白，包含一個保守的YTH domain [61]，甚至它都包含那幾個保守的芳香族氨基酸，但是它並不偏好結合m6A修飾的RNA。Mmi1識別的RNA序列與GGACU大不相同，為U(U/C)AAAC，被稱為DSR motif。有趣的是，若是使DSR序列的A甲基化，那麼DSR與Mmi1的相互作用將減弱，而不是加強。這與它的結構有關。Mmi1結合RNA是通過一個溝壑，而不是芳香族的“籠子”。盡管Mmi1的芳香族氨基酸在序列上保守，但是在結構上並不保守，Mmi1的W428相對“籠子”而言旋轉瞭90°左右，是的“籠子”處於關閉狀態，阻擋瞭甲基基團的進入。而且，在Mmi1的假想的籠子附近，富集瞭許多負電荷氨基酸（D358, D360, D423, E441, and D453），這使得與RNA的相互作用產生瞭電荷排斥 [61]。因此，Mmi1使不太可能喜歡m6A修飾的RNA的。

對於另外的一些RNA結合蛋白，也有報道很多都能結合m6A修飾的RNA。舉幾個例子：HNRNP A2B1包含多個RRM domain，可以結合RNA，開始被報道可能作為m6A的“讀碼器”[63]。但是最近的報道證實HNRNPA2B1並不喜好結合m6A修飾的RNA，它影響m6A修飾的RNA可能使通過影響RNA“開關”--m6A修飾會影響RNA的折疊和穩定性，從而影響與RBP的相互作用--的方式 [64]。FMR1蛋白（fragile X-linked mental retardation syndrome protein 1）與脆性X綜合征相關，綜合征患病者表現為智力低下。FMR1被報道可以以序列依賴的方式結合m6A修飾的RNA，但是由於實驗結果使通過免疫共沉淀得到，所以具體其相互作用使直接的還是間接的還不清楚 [65]。IGF2BP s（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins)蛋白具有多個串聯的KH結構域，也是一類RBP。最近，IGF2BPs被作為一個潛在的m6A“讀碼器”蛋白被報道。它可以增強mRNA的穩定性，並且可以通過m6A依賴的方式介導RNA的翻譯過程 [66]。其他被報道可能作為m6A“讀碼器”的蛋白還包括eIF3（eukaryotic initiation factors 3），hnRNPC ，hnRNPG，ELAVL1等RNA結合蛋白[4, 6, 14-16]。這些蛋白究竟能不能作為m6A的“讀碼器”，等待時間的檢驗和大牛的公斷。

後記：

就是在這樣一個火熱的領域中，有關它的爭議也是一直沒有休止。有關它的分子機制是否動態 [67, 68]，它的催化過程具體有哪些蛋白參與調控，又是怎麼調控；它是否受時空性表達等問題，或是充滿爭議，或是等待後續研究的發掘。借用Huang & Yin review文章中的一句話，也是莎士比亞的一句名言--“What's past is prologue”！

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