摘要

細小病毒是貓病毒群的常見病毒，通常會導致貓的胃腸炎和白細胞減少癥。在本研究中，我們從中國傢貓中鑒定瞭一種新的原細小病毒，它在遺傳上與犬細小病毒相似(98.0%-99.8%)，但在病毒結構蛋白2(VP2)中與眾所周知的犬細小病毒2型和貓泛白細胞減少癥病毒具有低氨基酸同源性(36.1%-37.2%)。這種病毒暫時命名為貓 bufavirus (FBuV)。糞便樣本篩查顯示傢貓的患病率為7.4% (19/257)。FBuV陽性的貓中有52.6% (10/19)出現腹瀉。然而，統計分析顯示FBuV和臨床癥狀之間沒有聯系。對19株FBuV的VP2基因進行瞭測序，系統發育分析表明，來自中國的FBuV具有遺傳多樣性。本研究將加深對佈氏病毒流行病學和遺傳多樣性的認識，為進一步研究提供基礎。

細小病毒是一種小型、無包膜的單鏈DNA病毒。DNA基因組長度約為4.5–5.5 kb，在5′和3′端具有復雜的發夾結構，編碼3或4種蛋白質：非結構蛋白1（NS1）、核蛋白1（NP1）、病毒結構蛋白1和2（VP1和VP2）（Cotmore et al., 2014）。細小病毒屬於細小病毒科。該傢族中的病毒主要分為三個亞傢族：細小病毒亞科，其中包含感染脊椎動物宿主的病毒；濃核病毒亞科，包括感染節肢動物宿主的病毒；以及包括無脊椎動物和脊椎動物病毒的Hamaparvovirinae（P ́enzes et al., 2019; Souza et al., 2017）。細小病毒亞科包括博卡病毒屬和原細小病毒屬（Martino et al.，2019；Miranda et al.，2017），其成員已在包括傢養食肉動物在內的多種哺乳動物物種中鑒定。

貓細小病毒(原細小病毒屬)廣泛存在於貓中，通常引起貓胃腸炎和白細胞減少，具有高死亡率和發病率(Liu et al., 2020)。最近，在貓中發現瞭幾種新的細小病毒(表1)。2012年，香港報告瞭細小病毒亞科博卡病毒屬的一種新病毒，即貓博卡病毒(FBoV)(Lau et al., 2012)。目前，該病毒已被分為三種基因型，並在中國、美國、日本、葡萄牙和泰國有報道(Lau et al., 2012; Ng et al., 2014; Zhang et al., 2014)。2019年，在加拿大的一個多設施貓科動物收容所中描述瞭貓cha-phamaparvirus(FEC HPV)，屬於一個名為Hamaparvovirinae的新亞科(Li et al., 2020)。目前，FeChPV已被鑒定為貓病毒組的共同成分。流行病學研究表明，FeChPV感染在患有急性腸胃炎的貓中很常見(Di Profio et al., 2021)。

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2019年，在意大利從患有呼吸道癥狀和腹瀉的貓身上鑒定出瞭另一種新的細小病毒（Diakoudi et al., 2019），該病毒與犬bufavirus（CBuV）基因相關。CBuV於2018年在意大利被發現（Sun et al., 2019a），但目前是一種未分類的原細小病毒，符合國際病毒分類委員會（ICTV）劃分細小病毒科的分類標準(http://talk.ictvonline.org/taxonomy). 在之前的研究中，FBuV在貓中的流行率為9.2%，這表明FBuV似乎已成為貓病毒群中的一種常見元素。然而，FBuV自首次發現以來，僅在意大利有報道。在這項研究中，首次從中國傢貓的糞便樣本中鑒定出FBuV，這為進一步瞭解BuV的分子特征和流行病學提供瞭更多信息。

2020年，共從中國廣東省健康或腹瀉的傢貓身上采集瞭257份糞便樣本。這些動物包括221隻健康貓和36隻腹瀉貓（表2）。糞便樣品在Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）中以1%的比例勻漿，然後在4◦C培養20分鐘以收集上清液。根據制造商的說明，使用MiniBEST病毒RNA/DNA提取試劑盒（日本Takara）從200μl上清液中提取每個樣本的基因組DNA，然後儲存在-80◦C，直到進一步使用。

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為瞭檢測BuV的存在，使用如前所述的特異性引物(CPPV-165 f 5′-ctggtttaatccagact-3′和CPPV-371 r 5′-TGAAGACCAAGGTAGTAGGT-3￡)通過聚合酶鏈反應對所有樣品進行瞭檢測(Diakoudi et al., 2019)。電泳顯示PCR產物為預期的202 bp大小，表明為BuV DNA陽性。然後使用FastPure凝膠DNA Extraction Mini Kit (Vazyme，Nanjing，China)純化擴增的DNA片段，並克隆到pCloneEZ-TA載體(Clone Smar- ter，USA)中，通過轉化導入大腸桿菌DH5α感受態細胞(狄威，China)中並測序。培養12小時後，挑取細菌克隆並通過PCR鑒定，陽性大腸桿菌克隆被鑒定並送去測序(中國武漢天一)。對http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi NCBI數據庫中陽性樣本測序結果的BLAST分析顯示，與以前報道的BuV毒株相比，BuV的核苷酸相似性為99.32%-100.00%。

基於可獲得的CBuV基因組序列，使用兩個不同的引物對擴增VP2編碼區的部分基因組，正向引物FBuV-2686 f(5￣cgcaaagacaggtccatctt-3￣和反向引物FBuV-2905 r(5￣tatttcaaagttcattgca-GATT GCT-3￣2 );正向引物FBuV-2800 f(5-CACTA-TAAATGACTCTTACCATGCA-3)和反向引物FBuV-3256 r(5-AGTTCGATTGGTACACAGTTTTC-3)。使用Phanta Max超保真DNA聚合酶(Vazyme, China)擴增目標片段(244 bp和480 bp ),然後純化並連接到pCloneEZ載體(Clone Smarter, United States)中。通過轉化將質粒轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞(Weidi, China)中並測序。用SeqMan 7.1.0組裝陽性樣品的核苷酸序列。

PCR檢測顯示，257份糞便樣本中有19份FBuV陽性，總陽性率為7.4% (19/257)。腹瀉癥狀組FBuV陽性率為27.8% (10/36)，無任何臨床癥狀組為4.1% (9/221)(表2)。然而，統計分析顯示FBuV的存在與臨床癥狀之間沒有關聯(P > 0.05)。所有19個毒株中FBuV的部分VP2編碼區為594 BP(GenBank登錄號:MW970061 - MW970076和MW 6889)這些毒株與意大利報道的FBuV毒株的遺傳相似性為99.2%-99.8%，與犬BuV的遺傳相似性為99.2%-100.0%。

為瞭瞭解本研究中鑒定的FBuV株與其他bufavvirus株之間的進化關系，從GenBank數據庫中獲得瞭其他bufavvirus株的vp2編碼序列。在使用“尋找最佳DNA/蛋白質模型”程序進行估計後，使用Tamura-Nei模型構建瞭具有gamma分佈和不變位點(G+I)替換的最大似然(ML)系統發育樹，使用MEGA 6.06進行1000次引導重復。與其他bufavvirus株相比，FBuV毒株和CBuV毒株緊密聚集，遠離其他毒株（圖1A）。基於食肉動物原細小病毒的分支表明，從中國鑒定出的肉食性bufavvirus毒株與從其他地區分離出的犬和貓bufavvirus株相對遙遠(圖1B)。值得註意的是，菌株GD64在進化樹中形成瞭單獨的分支，使得中國FBuV變異更加多樣化。

圖1.利用MEGA 6.06進行最大似然法和1000次引導復制的啟發式搜索。基於VP2部分基因組（594 bp）的buv系統發育樹。B系統發育樹中食肉動物分支的放大視圖。經國際國傢病毒分類委員會正式承認的原細小病毒與非分類（NC）原細小病毒一起包括在內。提供瞭參考菌株的GenBank登錄號。本研究中的菌株用黑色圓圈

近年來，由於第二代測序（NGS）和元基因組學的發展，已經發現瞭幾種新型細小病毒。bufavvirus於2012年在佈基納法索首次在急性腹瀉患者的糞便中檢測到（Phan et al., 2012）。從那時起，在全世界所有年齡段的患者的腹瀉糞便中都發現瞭人類BuV（Altay et al., 2015; Daleno et al., 2012; Huang et al., 2015; Yahiro et al., 2014）。隨後，發現瞭幾種新物種感染瞭BuV，如蝙蝠（Kemenesi et al., 2015）、鼩和非人靈長類動物（Sasaki et al., 2015）、豬（Hargitai et al., 2016a）、大鼠（Yang et al., 2016）、犬（Sun et al., 2019a）和貓（Diakoudi et al., 2019）。在中國，BuV於2015年首次從急性腹瀉患者中檢測到（Huang et al., 2015）。五年內，在大鼠（Sun et al.，2020；Yang et al.，2016）、豬（Sun et al，2020）和犬（Sun et al., 2019a）中發現瞭BuV感染的進一步證據。在這項研究中，我們發現傢貓體內存在BuV感染，這表明BuV在中國的宿主范圍正在擴大。

作為一種DNA病毒，細小病毒的突變率低，VP2基因具有高度的遺傳和抗原多樣性（Doan et al., 2021）。與已知的犬細小病毒2型和貓泛白細胞減少癥病毒相比，新型貓原細小病毒VP2基因的nt（54.8-55.3%）和aa（36.1-37.2%）同源性較低，與犬bufavvirus的相似性最高（98.0%-99.8%）。此外，本研究中分離到的一些貓bufavvirus毒株VP2基因突變率很高，其中GD64與其他毒株相差甚遠，並在系統發育樹中形成瞭一個單獨的分支，這表明在中國流行的bufavvirus具有遺傳多樣性。

中國有大量的寵物，廣東省的寵物數量最多，約占全國寵物總數的11%(http://news.dayoo.com/guangzhou/202101/08/超過80%的傢養寵物是貓和犬，它們有著密切的親緣關系，經常共享相似的棲息地，這為病毒在它們之間的物種間傳播提供瞭優勢。已經證實，冠狀病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒和細小病毒可以在這兩個物種之間傳播（Shackelton et al., 2005; Lau et al., 2012; Herrewegh et al., 1998; Truyen, 2006）。在本研究中，系統發育分析表明，中國貓BuV毒株與從中國分離的CBuV毒株更為密切，並聚集在意大利貓bufavirus毒株的不同分支中，這表明在中國傳播的bufavirus可能是貓和犬之間的共同進化，並對傢養寵物構成威脅。

Bufavirus可感染所有年齡的人和動物，受感染的動物可能會出現呼吸道和/或腹瀉癥狀（Ayouni et al., 2016; Li et al., 2019; Liu et al., 2016; Yahiro et al., 2014）。有人提出，BuV可能與豬的後部麻痹有關（Ayouni et al., 2016; Li et al., 2019; Liu et al., 2016; Yahiro et al., 2014）。BuV在人、豬和犬中的患病率分別為0.27%-1.1%、0.86%-23%和1.85%-31%（Sun et al., 2019b; Wang et al., 2020; Yahiro et al., 2014）。FBuV於2017年在意大利首次被識別。在這項研究中，傢貓（9.2%）的FBuV被測定，尤其是幼貓。該病毒在鼻和口咽標本中的患病率（10.2%）高於腸道標本（2.2%）。此外，有呼吸道癥狀的貓的陽性率（16.4%）高於無癥狀動物（8.7%）。在本研究中，257個樣本中有19個樣本FBuV陽性（7.3%），FBuV呈陽性病例中也發現瞭腹瀉癥狀（10/19）。然而，需要進一步嘗試分離FBuV並在貓身上進行chal-lenge實驗，以研究貓bufavirus的致病性。

總之，我們在中國發現瞭一種新的貓細小病毒，它在遺傳上與犬科bufavvirus相關。介紹瞭FBuV的流行、基因組特征和遺傳多樣性。此外，貓科和犬科bufavvirus之間的高度相似性表明，這兩種食肉動物物種之間可能存在種間傳播。這些結果豐富瞭對中國BuV流行病學和遺傳多樣性的認識。

CRediT作者貢獻聲明

Ran Shao: Conceptualization, Investigation, Writing – original draft.

Cundong Ye: Software, Validation, Writing – review & editing. Ying Zhang: Data curation. Xingrong Sun: Resources. Jiaojiao Cheng: Investigation. Feiyan Zheng: Resources. Siqi Cai: Formal analysis. Jinzhao Ji: Resources. Zixin Ren: Resources. Lintao Zhong: Resources. Zhiying Lai: Resources. Jiajun Ou: Methodology. Gang Lu: Supervi- sion, Funding acquisition. Shoujun Li: Supervision, Project administration.

競爭利益聲明

作者聲明他們沒有利益沖突。

資金

這項工作得到瞭國傢自然科學基金（31702271）和廣東省自然科學基金資助（2017A030310367）。

倫理批準

這項研究沒有涉及任何人類參與者或活體動物實驗。

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