一、背景知識介紹

1.1 精子在附睪成熟

精子在附睪運輸過程中獲得其受精能力和向前運動特性，通過境附睪的雄性配子所經歷的這些修飾被稱為精子成熟。附睪是分泌能力最強的器官之一，精子通過附睪時能夠獲得許多由附睪分泌的物質（蛋白、RNA、DNA等），這些物質主要由附睪小體（epididymosome）負載，然後結合到精子的頭部（絕大部分）和中段，這些物質在後期的精卵結合以及雌性生殖道的適應過程中起著重要作用。其他功能歸因於附睪，例如精子濃度和運輸，雄性配子的免疫保護及其作為精子庫的作用。人類中的血管傳出不是連接睪丸和附睪小管的直小管。一些傳出管是盤繞的，一些是分支的，而另一些是無窮無盡的，不與附睪小管融合。

（圖1 小鼠睪丸-附睪解剖圖）（Cited：doi: 10.1186/s12894-017-0215-5）aa245e773f71517431ef414aecb43fa0（圖2 精子發育過程示意圖）（Cited：Gennady et al., 2014 DOI:10.1186/1471-2164-15-39）

小鼠睪丸從精原細胞到圓形精子需要天，到長型精子需要35天，在附睪中存儲約15天。

1.2 附睪對來自睪丸精子水分吸收（濃縮精子）

從對嚙齒動物物種的研究中，我們瞭解到輸出管（efferent duct）對水的重吸收與腎臟一樣有效，主要發生在附睪的起始段（initial segment，IS）。參與水重吸收的Na / H/ATP酶的表達是雌激素依賴性的，並且在血管傳出中很高；其表達沿附睪延展逐步減少。事實上，據報道，起始段附睪中的雌激素濃度非常高。雌激素在傳出管功能中的作用可以通過性雌激素受體敲除小鼠很好地說明。在該模型中，由於與血管傳出無法重吸收腔內水相關的水積聚，睪丸體積顯著增加。一些可能參與水轉運的離子轉運相關蛋白已經沿著傳出管和近端人附睪進行瞭免疫檢測。可能參與水運動的這些蛋白質的細胞表達和組織分佈顯示出人類和動物模型之間的差異，表明人類男性生殖道中存在功能特異性。人附睪在水重吸收中的作用仍有待澄清。

1.3 附睪解剖圖

小鼠和大鼠的附睪已根據結締組織隔的存在分別細分為10和19個區域內節段。簡單的科研分為初始端（initial segment），頭（caput），體（corpus），尾（cauda）。後者將附睪分成不透水的子區室，如在給定節段的管間空間中註射的高分子量染料無法擴散到相鄰空間所示。在實驗室動物中，通過結締組織隔膜分隔附睪間質可能限制旁分泌因子對特定附睪節段的影響。迄今為止，沒有實驗證據支持這一假設。在實驗動物中，已知初始片段（initial segment）是更活躍的附睪片段，並在精子成熟中起主要作用。原癌基因c-ros的表達與小鼠的初始節段分化有關，因為它僅在分化的附睪的這一節段表達。c-ros敲除小鼠中c-ros表達的喪失與缺乏分化的初始節段導致男性不育有關。

29034706b156e249a79ae023f8658b5d附睪的解剖結構。小鼠（A）和大鼠（B）附睪的示意圖，說明通過結締組織隔膜分割附睪間質。（C）大鼠附睪近端區域縱向組織學切片的顯微照片。根據（B）繪制結締組織隔。（D）從睪丸中解剖的人類附睪的照片。（cited：The human epididymis: its function in sperm maturation）。

1.4 附睪蛋白組、轉錄組，胞外囊泡（extracelluar vesicles, EVs）組學

精子是一種高度極化的細胞，在精子發生過程中消除瞭大部分細胞質和細胞器。已知該細胞在轉錄和翻譯上是沉默的。完整的射精，精子以及分離的亞細胞區室（如頭部，尾部，細胞核和膜）已經過蛋白質組學分析。在人類精子裂解蛋白組中已經鑒定出超過5000種蛋白質。附睪腔內隔室的蛋白質組成沿著附睪變化，並且每個片段都有自己的蛋白質組和分泌組特征。在附睪液中已經鑒定出數百種蛋白質，並且一些物種差異是顯而易見的。在所有優生物種中，<20蛋白占附睪腔內蛋白總含量的80-90%，包括簇蛋白，前列腺素D合酶，谷胱甘肽S-轉移酶，脂質鏈酶5和Niemann-Pick C2型疾病蛋白。根據Dacheux等人的說法，白蛋白幾乎占人附睪液總蛋白質含量的50%。

（圖4 人類附睪組學分析）（Cited：The human epididymis: its function in sperm maturation）

1.5 附睪功能總結

在嚙齒動物中，近端附睪（IS和caput）是對控制下遊基因表達而提出的腔內因子反應最靈敏的片段。因此，附睪在以片段特異性轉錄組特征為特征的基因表達中非常活躍。在這些物種中，隔膜沿著附睪定義瞭不同的隔室。據推測，這些結構也參與基因表達的調節。毫無疑問，當考慮到沒有初始節段，由傳出管形成的近端帽以及存在定義不明確和不完整的隔膜時，人類附睪的解剖結構是特殊的，這些隔膜不能清楚地標記附睪隔室。這些觀察提出瞭關於該器官在人類中的功能意義的問題。快速的精子運輸，附睪小管相對較小的直徑和分化不良的尾段也給人的印象是附睪對人類精子成熟可能不如實驗室動物所示那麼重要。相比之下，轉錄組學和蛋白質組學研究告訴我們，基因表達的模式沿著人附睪變化，而caput片段具有最高的轉錄組學活性。結合有關正常男性附睪生理學的現有信息，這些觀察結果支持瞭人類附睪精子成熟的概念。

人類的附睪是“可塑的”，正如輸精管切除術對附睪轉錄組（特別是在IS）的影響所顯示的那樣。我們對附睪精子參數的幾乎所有知識都是基於在附睪阻塞和發育不全的情況下沿男性束收集的精子細胞。如果輸精管切除術後附睪中存在的精子與阻塞器官中收集的精子相當，則關於人附睪功能的結論可能會被扭曲。應該記住，僅經歷部分附睪凌運的精子受精能力有限，並且必須應用ART（例如ICSI）來產生具有這些雄性配子的受精卵。

二 小鼠附睪尾取精實操

2.1 器材準備

解剖器材、75%酒精、解剖鏡、胚胎培養液、精子保存液（可購買/或者自行配制）。

2.2 操作步驟

（1）將小鼠麻醉後，斷頸處死；

（2）將小鼠腹部使用75%酒精擦拭3遍；

（3）腹部橫向剪開一個小口子，然後將小鼠腹部被皮扯開；

（4）將小鼠腹腔膜發開，可將小鼠睪丸組織；

（5）根據睪丸定位附睪，找到附睪，並將這個附睪剝離（務必小心獲得完整的附睪）；

（6）將剝離的附睪轉移至PBS液體中；

（7）將小鼠附睪尾剝離，並轉移至精子保存液中；

（8）將附睪尾用眼科鉗剪碎，然後放置在37℃水浴鍋中，作用10分鐘作用；

（9）水浴完成以後，可吸取部分液體進行精子圖片並鏡檢（一般使用CASA），可見從附睪尾遊出來大量的精子；

（10）根據實驗需求（精卵結合/精子運動力/畸形率/總蛋白/DNA/完整性/抗氧化活性等），處理從附睪尾獲得的精子。

（理論+實踐展示，附睪這部分這是我的強項，嘿嘿，有什麼不懂的或者我講的不恰當的地方請留言，我們一起完善！！！）