P53是细胞应激的主要调节因子，也是人类癌症中最常见的突变基因之一，超过50%的p53信号通路异常的肿瘤细胞中都发生了P53基因突变[1]。p53在DNA损伤修复、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤发生上扮演着至关重要的角色，是一个极具潜力的药物开发靶点，目前已有15款不同形式的p53靶向药物进入临床试验，包括小分子、基因治疗等，但尚未有药物获批。本文将详细阐述P53这个传奇抑癌基因的发现与发展过程、其在生理与病理过程中的重要作用以及目前针对p53/MDM2信号通路的靶向药物研发进展。

科学家们在发现与认识P53基因的过程中经历了一次转折，随着DNA克隆技术的发展P53神秘的面纱才逐渐被揭开。这个进化上高度保守的抑癌基因在DNA损伤修复、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤发生上扮演着至关重要的角色，近几年其在组织再生、细胞凋亡诱导的增殖、细胞间协调生长与竞争等方面的非经典功能也开始受到关注。MDM2是一种E3泛素连接酶，其与p53结合后会使后者被蛋白酶体降解，因此MDM2是p53的一种负调节因子，p53与MDM2之间还存在着负反馈调节来维持正常细胞内p53含量的稳定[2]。p53功能的精细调节对于细胞命运至关重要，在p53功能的多层调控机制中，翻译后修饰（posttranslational modifications，PTM）代表了一种有效而精确的方法，那各种PTM具体是怎么调控p53的功能的呢？人类肿瘤细胞中存在着高水平的致癌p53突变体，这也是为什么最开始科学家们误以为P53为原癌基因，那这些功能获得性（Gain of function，GOF）突变又是怎么影响到p53功能的呢？既然P53功能这么强大，那靶向P53/MDM2的抗肿瘤药物研发进展如何呢？接下来我将为您详细解答以上问题。

一. P53从“魔鬼”到“天使”的发现历程

1.1. P53被误认为原癌基因

p53蛋白是由三个独立的科研团队相继发现的。由小型DNA肿瘤病毒（例如猿猴病毒40（SV40））在实验动物中诱导的肿瘤通常会表达少量的病毒蛋白。这些蛋白质被宿主的免疫系统识别，进而导致产生针对它们的抗体。到19世纪70年代中期，这类抗体作为识别和监测病毒基因组编码并在转化细胞中表达的蛋白质（病毒肿瘤抗原）的工具开始流行。就SV40而言，以这种方式鉴定出的两种病毒蛋白分别称为大T抗原和小T抗原。[3] 大T抗原很大程度上决定了SV40的转化与致瘤活性。David Lane团队在1979年3月通过有效的免疫沉淀发现一种分子量约为53kDa的细胞蛋白与Sv40大T抗原的复合物。[4] 2个月之后，另外两个科研团队的研究发现在非病毒诱导的肿瘤中也会产生针对这种蛋白的抗体，表明这种蛋白独立于肿瘤抗原在细胞中存在的。[5, 6]之后Varda Rotter的研究表明这种蛋白在逆转录病毒（Abelson murine leukemia virus）诱导的肿瘤细胞中过表达，但是在未转化的细胞中很少几乎检测不到。[7]因此研究者们顺理成章的将这种蛋白鉴定为细胞肿瘤抗原。1983年，在英国Oxted举行的第一届p53国际研讨会上，经各个研究小组的代表讨论后，将这种蛋白统一命名为“p53”。不难想到53是因为该蛋白的分子量约为53 kDa，有趣的是后来意识到，这是一个高估，大概是由于存在富含脯氨酸的区域，该区域会减慢蛋白质在此类凝胶中的迁移。实际上，人p53蛋白的正确分子量只有43.7 kDa，而小鼠蛋白的正确分子量甚至更低[3]，但是谁敢再改变一个已经约定俗成的名字呢？

1.2. P53成为明星抑癌基因

为了验证p53是一个肿瘤抗原，需要通过实验证明p53的致癌特性。实验的关键在于获得编码p53蛋白的基因，以便特异性地操纵p53的表达，并在体外和体内评估这种操纵的生物学效应。早期的科研团队从高表达“p53”的肿瘤细胞系中获得了“p53”cDNA克隆，并通过实验验证“p53”过度表达有致癌作用。转染的“p53”可以与几种已建立的致癌蛋白有效结合，尤其是HRAS。当“p53”过表达时，可以转化培养中的原代细胞，并可以促进这种细胞的永生化。[8]在这些测定中，“p53”的功能与MYC癌蛋白有些相似。但在80年代中期，4位科学家却得出了相反的结论，P53可能是抑癌基因。他们的研究表明，病毒诱导的白血病细胞会抑制P53表达，[9]在人类白血病衍生细胞系中发现P53编码序列的缺失将促进癌症的发生。[10]但是由于当时普遍认为p53是一个原癌基因，故真理被淹没在了大海之中。

之后又有研究者发现从小鼠正常组织中克隆得到的wide-type P53 cDNA并没有促进细胞转化的作用，这与之前的结论矛盾，问题究竟出在哪里呢？Cathy等人将之前各个研究团队从肿瘤细胞中克隆出来的“p53” cDNA序列进行比对，发现竟没有两个是一致的。[11]通过广泛的人类癌症样品DNA测定以及体外功能分析，研究者们最终确证肿瘤细胞中wide-type P53多突变、缺失，这是抑癌基因的重要标志。肿瘤细胞中P53的突变等位基因会导致内源性wide-type P53显性阴性失活并且因GOF突变而真正具有了致癌活性。之前误认为p53具有致癌活性的研究，皆克隆的是P53或Trp53（鼠源）在肿瘤细胞中高表达的突变等位基因，进而得出了完全相反的结论。后大量研究表明P53是各类型肿瘤中最常突变的抑癌基因，使P53一跃成为了抗癌的明星基因，接下来我将给大家解释为什么它如此重要。

图1：p53发现与发展的传奇30年

二. p53-MDM2信号通路

2.1. p53蛋白结构

人类p53样转录因子家族由P53、P63、P73这三个基因编码。它们编码的三种蛋白p53、p63、p73具有相似的蛋白结构域，但在作用部位和功能上存在差异。例如p63只在生殖系中发挥诱导异常细胞死亡的功能，因此具有维持遗传稳定的作用。[12]目前研究发现，植物、真菌、古细菌不存在类p53家族蛋白，鞭毛藻中含有p53同源物，据估计鞭毛藻与人类共同祖先大约生活在6~8亿年前，可能是最早的多细胞生物之一。较复杂的动物，如海葵、苍蝇、果蝇、蠕虫等都具有与人p53、p63、p73 DNA结构域高度同源的蛋白质。[13]P53基因家族6~8亿年间进化高度保守，可见其在生物体中具有不可替代的重要作用。

p53是调控转录的序列特异性DNA结合蛋白，由两个N末端反式激活结构域（transactivation domain，TADs），一个保守的脯氨酸富集结构域（PRD），一个中央DNA结合结构域（DBD）和编码其核定位信号的机构域NLS以及影响转录调节活性的寡聚化结构域（OD）的C末端调节结构域（CTR）组成。（图2）与p53介导的转录在肿瘤抑制中的重要性相一致，绝大多数源自肿瘤的P53突变都发生在编码p53的DNA结合域的区域。[1]在脊椎动物和果蝇中都发现了p53蛋白同源异构体（isoforms），这揭示了p53功能和调节的复杂性。[14]同源异构体的表达受到差异调节，在控制适当的细胞反应中起到关键作用，同源异构体表达和丰度异常将诱导肿瘤发生，并对肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性有深远影响。人类中存在的p53亚型可分为两类：反式激活形式（p53）和N端截短的亚型（Δ40p53和Δ133p53），它们缺乏完整的TAD（图2）。[15]

图2：p53蛋白同源异构体（isoforms）的示意图

2.2. p53-MDM2枢纽

MDM2（Murine Double Minute 2）基因是p53的靶点基因，同时MDM2蛋白也是机体内重要的p53抑制因子。MDM2是一种E3泛素连接酶，当它与p53的TA结构域结合后，会使p53被蛋白酶体降解。正常细胞中存在p53-MDM2负反馈调节，当wide-type p53在细胞累积时，会促进MDM2的表达，进而又使p53含量下降并维持稳定，而突变的“p53”与MDM2间不存在这种调节。[16, 17]如果细胞中有大量的“p53”累积，说明细胞活性已经不好并有癌变的倾向。[18]

在各种内在或外在的刺激下，MDM2蛋白对p53的亲和力或其连接酶活性会发生改变。[19]若MDM2活性受到抑制，则会延长p53的半衰期并使其迅速激活下游的靶基因，从而修复这些刺激引起的基因损伤或者诱导细胞凋亡。（图3a）如SDM2以较高的连接酶活性与p53结合，则导致p53被蛋白酶体降解含量下降。（图3b）一旦p53稳定并被激活后，它就通过调节靶基因转录与广泛的细胞信号转导通路建立联系（图3c），涵盖了多种细胞功能，最终修复刺激引起的基因损伤或者诱导凋亡。因此，p53-MDM2是细胞整合多种刺激信号并将其传递给下游通路的一个重要枢纽。

图3：a.导致p53激活的刺激信号。b.导致p53抑制的刺激信号。c. p53整合各种刺激后的转录调控输出

如图3c所示，p53通过调控众多靶基因的转录，协调多条信号通路，发挥着许多重要的功能。经典的p53功能也是研究最多的功能，比如诱导细胞凋亡、控制细胞周期进程、DNA损伤修复等。（1）细胞凋亡：在DNA损伤的情况下，p53可以转录激活经典的促细胞凋亡基因（如PUMA、BAX和MXA）以及其他具有促凋亡功能的基因（如死亡受体（DRs）FAS、TNF受体家族的DR4和DR5）进而促进细胞凋亡。除此之外，p53还可与胞浆或线粒体膜上的凋亡调节因子通过蛋白-蛋白作用来调控细胞凋亡。[20]（2）细胞周期滞留：p53依赖的细胞凋亡阻止了损伤细胞的累积，p53还具有滞留细胞周期并促进DNA损伤修复的能力。p53通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21或抑制磷酸酶Cdc25c分别破坏G1-S和G2-M的转换来阻滞细胞周期。（3）DNA修复，维持基因组稳定：p53诱导可逆的G1检查点，并促进DNA修复使细胞能在进一步分裂前纠正DNA损伤。[21]（4）细胞衰老：研究表明，某些情况下，肿瘤的抑制取决于p53诱导的细胞衰老（永久性细胞周期停滞）能力。P53介导的衰老可由端粒丢失，复制刺激或致癌信号触发，并依赖于p21的转录激活。持续的p21表达导致p16INK4A上调并激活视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），从而促进衰老程序，通过该程序，无论是否存在增殖信号，细胞都无法重新进入细胞周期，从而防止不受限制的生长。经历衰老的细胞会产生多种分泌因子，统称为“衰老相关分泌表型”（SASP），SASP可通过先天免疫系统促进肿瘤细胞清除，但也可通过诱导生长和侵袭而促进肿瘤发生。[22]除了经典功能外，最近的研究表明，p53在许多其他与维持组织稳态和机体存活有关的生理过程中发挥着非经典的功能，具有抑制肿瘤的潜在作用。p53的非经典功能涵盖在组织再生与细胞凋亡诱导的增殖中的作用[23]、协调生长[24]、细胞竞争[25-27]、细胞自噬以及在生物体水平对营养胁迫的适应性反应（维持代谢稳态）[1]等。

三. p53翻译后修饰与功能

p53功能的精细调节对于决定细胞命运至关重要。细胞内存在多层调控p53功能的机制，例如基因水平（突变或单核苷酸多态性）、转录水平（P53转录表观遗传抑制）、mRNA水平（选著性剪接产生同源异构体）[28]、蛋白水平、定位。在这些调控机制中翻译后修饰（PTMs）是最广泛且有效的一类。主要的p53 PTMs有磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化。其他PTMs，如磺酰化，糖基化，O-GlcNAc糖基化，二磷酸腺苷（ADP）-核糖基化，羟基化和β-羟基丁酰化也在p53调节中发挥着各种作用。（图4）PTMs具有以下共同特点：（1）多对多：一种PTM可对应p53上多个氨基酸位点，一个氨基酸位点也可对应多种PTMs；（2）多功能：PTMs对p53的调控作用因修饰位点、PTM种类以及环境不同而异，但也有种类不同但功能相同的PTMs；（3）可逆：每种PTM都有与之对应的一种或多种去修饰酶；（4）串扰：各种PTMs相互影响，协调p53功能。[29]PTMs调控p53功能的基本原理是影响其稳定性、构象、定位和结合伴侣等，其相关通路失调是与p53相关疾病的主要诱因之一，特别是癌症。[30]接下来我将详细阐述四种主要的PTMs修饰调控p53活性的机制。

图4：不同的p53 PTMs类别

3.1 磷酸化

p53上有很多丝氨酸（Serine，S）、苏氨酸（Threonine，T）位点可被磷酸化，这些位点遍布整个蛋白，但多集中于N端。在细胞未受到刺激时，wide-type p53上的T55和S378位点分别被TAF1与PKC磷酸化。[31]前者可促进p53的降解，在PP2A去磷酸化作用下，p53半衰期延长进而导致细胞周期滞留。后者促进PAb421-reactive形式p53向PAb421-negative形式转变，上调p53 DNA结合活性。大多数磷酸化仍是由刺激引起的，DNA各种损伤促使Ser-Thr激酶VRK1与Chk1/2分别磷酸化T18、S15&S20，下调MDM2对p53的抑制作用，提高p53稳定性。当损伤过于严重无法修复时，S46位点将被磷酸化并诱导细胞凋亡。除了TAD外p53其他结构域S、T磷酸化也发挥着重要作用。（表1）除此之外，磷酸化还可产生p53结合蛋白识别位点。C-Jun N端激酶磷酸化p53 PRD上T81位点，[32]T81磷酸化p53具有与其同家族蛋白p73二聚化的能力以决定细胞命运。T18磷酸化p53能特异性地将Pellinol募集到DNA损伤位点。[33]最新研究表明CDK4磷酸化p53的一个突变位点R249S，增强了p53的核定位能力并使其与P1N1结合，p53突变体与癌蛋白c-Myc相互作用并提高c-Myc依赖的rDNA转录。[34]

表1：p53除TAD外其他结构域S、T位点磷酸化例举

在损伤修复后，由于持续的p53激活会损伤细胞，不适合细胞恢复正常功能，故需终止p53反应。由于磷酸化在调节p53活性中起关键作用，因此p53的去磷酸化在恢复p53激活中非常重要也就不足为奇了。Ser-Thr磷酸酶的三种主要类型PP家族、PP 2型家族和PPM家族均参与了p53的去磷酸化调节过程。[39]

3.2 泛素化

泛素是一种由76个氨基酸组成，分子量约为8.5kDa的小分子蛋白。通过E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）、E3（泛素连接酶）三级级联反应将泛素结合到底物上，形成单泛素花或多泛素化底物。这种修饰的主要作用是靶向蛋白酶体降解的底物。同时，泛素化还可以调节蛋白质的定位、活性以及蛋白质与蛋白质间相互作用。MDM2就是一种p53特异性的E3泛素连接酶，在p53 CTD上有六个可泛素化的赖氨酸位点（K370、K372、K373、K381、K382、K386）。有趣的是，高活性水平的MDM2促进p53多泛素化与核降解，而低活性水平的MDM2单泛素化p53促进其核定位并与p53转录非依赖性功能相关。

除了MDM2，细胞中还存在别的特异性作用于p53的E3连接酶。TRIM69可泛素化p53，在白内障发生的进程中，TRIM69表达受到抑制，进而导致p53激活和白内障形成。[40]同家族的TRIM59与p53相互作用并诱导其泛素化和降解，从而促进胃癌发生。RING1通过直接泛素化p53致其降解来促进癌细胞的增殖和存活。[41]类似的，UBE2T、RBCK1和SMYD3可泛素化p53使其降解以分别支持HCC、肾细胞癌和卵巢癌的发展。[42-44]p53上的泛素也可以通过去泛素酶（DUBs）去除。疱疹病毒相关的泛素特异性蛋白酶（HAUSP，也称为USP7）是重要的p53调节因子，可以使p53去泛素化。除HAUSP以外，其他DUBs（包括USP3，USP11，USP15，USP49，OTUD1，OTUD5和ataxin-3）也可以去泛素化p53以影响其稳定性。[45, 46]细胞中还存在两种类泛素化修饰，sumoylation与neddylation。它们与泛素化不同，似乎无法影响p53的稳定性或定位，但是两者皆会抑制p53的转录激活活性。

3.3 乙酰化

蛋白乙酰化最开始是在组蛋白上发现的，后来也在一些非组蛋白（例如HMG-1、tubulin）上检测到，但并未受到重视，直到p53乙酰化的发现。[47]CBP与p300是一对辅激活蛋白，具有乙酰化组蛋白调节染色体变构的作用。Gu等人的研究表明CBP/p300与p53结合后促进了其转录活性，故猜测CBP/p300是通过乙酰化p53来调控其活性的。他们之后的研究确证了这个观点，CBP /p300在p53 CTD上具有多个赖氨酸乙酰化位点（K370，K372，K373，K381，K382和K386）。C末端乙酰化将增强p53与其靶基因位点的结合，从而激活下游通路，如细胞周期停滞，衰老或凋亡。[48]CBP/p300激活p53的机制可归纳为以下三点：（1）阻止位点被泛素化，提高p53稳定性；（2）阻止MDM2向p53反应启动子的募集，消除MDM2介导的抑制；（3）阻碍了p53与可抑制未应激细胞中p53的转录活性的SET酸性结构域的结合。[49]

另一个广泛研究的p53乙酰化位点是DBD上的K120，它由MYST HAT家族的三个成员（Tip60，MOF和MOZ）催化。Tip60将K120处的p53乙酰化，以选择性地诱导促凋亡基因（如PUMA和Bax）的表达，而不诱导细胞周期阻滞基因（如p21）的表达。机制上推测是Tip60乙酰化K120可能改变DBD的构象，从而产生靶标启动子选择性。K120通常在癌症中发生突变。源自肿瘤的突变体p53（K120R）在Tip60介导的乙酰化作用方面存在缺陷，从而废除了p53依赖性的凋亡激活，但对细胞生长停滞没有显著影响。最近，Liu等人的研究表明NAT10是p53激活的新型调节剂。有趣的是，NAT10既可以在K120处乙酰化p53，也可以泛素化MDM2使其降解，从而协同稳定p53，这揭示了p53修饰的复杂性。[50]p53的DBD上还有两个可以被CBP/p300乙酰化的位点（K164和K101）。K164乙酰化可诱导细胞周期停滞。K101乙酰化对于调节SLC7A11依赖性肥大症至关重要，具有K101R突变的p53将失去诱导SLC7A11表达的能力。[51]综上所述，p53 DBD上三个赖氨酸（K101，K120和K164）的乙酰化状态对于p53靶标选择性至关重要，DBD上的与p53众多功能（如自噬、代谢）相对应其他位点还有待进一步开掘。

乙酰化的p53可以被各种脱乙酰基酶脱乙酰基。含有组蛋白脱乙酰基酶-1（HDAC1）的复合物可以使p53脱乙酰基化，从而强烈抑制p53依赖性转录激活、细胞生长停滞和细胞凋亡。有趣的是，Mdm2可以通过向p53募集含有HDAC1的复合物来促进p53去乙酰化，从而消除了CBP/p300乙酰化对Mdm2对p53泛素化的障碍。最新研究表明HDAC6使K381/382的p53脱乙酰化。HDAC6选择性抑制剂A452阻断了HDAC6的核定位，导致K381/382处的乙酰化p53水平增加及其促凋亡活性上调。此外研究发现，组蛋白脱乙酰基酶SIRT3和HDAC8也可以使p53脱乙酰基。[52, 53]

3.4 甲基化

和乙酰化一样，甲基化先在组蛋白的修饰中发现，随后发现p53上的一些赖氨酸也可以被甲基化。SET7/9可甲基化p53 K372位点，这种修饰可以稳定p53并将其限制在细胞核中。同时，它也与某些靶基因如p21的转录增强有关。[54]但是，SET8单甲基化K382会减弱p53调控的靶基因转录。[55]SMYD2还可以在K370处甲基化p53，降低p53与其靶基因启动子的结合，从而抑制p53介导的转录。[56]除赖氨酸甲基化外，p53上的精氨酸也可以被甲基化。蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）负责R333，R335和R337处p53的甲基化，该修饰调节p53对DNA损伤的反应，并影响p53靶基因的特异性。[57]

然而，迄今为止，仅明确地定义了一种p53的脱甲基酶。Hang等人发现组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶LSD1可以使K370处的p53脱甲基化，从而消除其与共激活因子53BP1（p53结合蛋白1）的相互作用，进而抑制p53的功能。[58]总的来说，甲基化是最简单的修饰（结构上）类型，却对p53功能有着复杂的影响，更多的甲基化位点和调节机制还有待进一步研究。

四. P53突变与癌症的发生

癌变的过程中，不仅不同组织与特定的原癌基因或抑癌基因是相匹配的，而且这些基因突变发生的顺序对肿瘤的发生率以及良性到恶性状态的转变也很重要。通过对各种肿瘤中P53突变时间、顺序进行分析得出，P53可有效的作为初始可克隆的主干突变，迅速地将外胚层或中胚层来源的组织瘤化，故发生在年轻时期。而内胚层来源的组织特异性干细胞必须在有其他癌基因突变累积的基础上，P53基因突变才能致瘤，这类肿瘤发生时间一般在老年时期，并且P53突变意味着肿瘤从良性到恶性转变。[12]

“hot spot”突变是指人类癌症中最常见的P53突变，是位于DBD中的错义突变。“hot spot”错义突变是功能获得（Gain of function, GOF）癌基因的关键特征，而大部分分布在整个P53基因突变类型均可以导致其抑癌功能丧失。发生了GOF突变的P53基因失去了序列特异性结合能力的同时还获得了致癌活性，具有了癌基因的特征。DBD中R175，R248和R273氨基酸是p53致癌突变体（mtp53）最常见的GOF突变位点。（图5）有研究表明P53 GOF突变可以促进多药耐药基因的转录，相较于简单的功能丧失突变，发生于侵袭性更强的肿瘤中。因此，科学家们对P53基因改变的探索焦点发生了从简单的功能丧失（显性阴性抑制野生型p53）到更复杂的GOF突变的转变，多年的研究集中于确定GOF mtp53的作用。[59]研究表明，GOF mtp53的作用可能不仅限于转录功能改变。[60, 61]GOF mtp53维持了wide-type p53 N末端（AD）和C末端（CTD）结构域，随着对这些区域中的氨基酸残基调节干细胞和癌症生物学中p53作用更多的了解，这些区域在GOF mtp53蛋白中的功能越来越受重视。[62]

图5：p53蛋白结构

p53-MDM2是细胞整合细胞内外大量刺激信号的枢纽，并通过转录调控下游靶基因或非转转录依赖性功能快速地对这些信号做出应答。细胞对刺激的应答，为什么是这种多对一然后又一对多的模式呢？无疑p53-MDM2枢纽的存在大大提高了信号传递的效率，而且当某个p53下游靶基因发生突变时，只要p53功能正常，细胞就可以通过其他下游信号通路发挥抑癌作用，进而减少了肿瘤的发生率。但是这种模式也有一个致命的缺点，就是一旦P53基因发生突变，细胞中的抑癌通路就将被完全逆转。TP53种系突变的Li–Fraumeni综合征患者家族患癌率约为93%，只有7%的人幸免于临床上可观察到的肿瘤。[63]所以靶向p53-MDM2枢纽的药物研发以抑制或使mtp53功能恢复正常将会是肿瘤治疗中拨乱反正的关键，下一节将详细介绍靶向p53-MDM2药物的研发进展。

五. 靶向p53-MDM2药物研发进展

小分子药物可以通过干扰p53-MDM2复合物的形成以阻止p53蛋白泛素化降解；修饰p53转录活性区并稳定p53蛋白两种途径来抑制肿瘤。主要的治疗方法有以下三种：（1）上调p53或下调MDM2表达；（2）抑制MDM2泛素连接酶活性；（3）阻断p53-MDM2结合。

5.1.靶向P53基因的药物

大量研究表明p53功能药理学活化本身是可行的癌症治疗选择，可以通过恢复p53功能来治疗疾病。Vladimir等人发现PRIMA-1（p53-Reactivation and Induction of Massive Apoptosis-1）可通过恢复mtp53的转录反式激活功能来诱导肿瘤细胞凋亡，体内外的实验均证明PRIMA-1安全、有效。PRIMA-1甲基化后得到PRIMA-1Met（又称APR-246）效果更加明显，目前正处于临床二期阶段。Yu和Kowthar两个科研团队分别通过NCI化合物库与CHEMSAS®平台筛选到6个硫代氨基脲（thiosemicarbazone）类化合物（包括了COTI-2）可以有效抑制mtp53活性，诱导肿瘤细胞凋亡。[64]除此之外，Rauf等人发现了另一种化合物PhiKan083 可以重塑mtp53。Y220C是癌症中最常见的突变位点之一，其中酪氨酸的半胱氨酸替代降低了热力学稳定性。PhiKan083是咔唑衍生物，可与p53的Y220C突变位点结合，并减慢其热变性速率。

5.2. MDM2抑制剂

MDM2是p53重要的内源性抑制因子，故抑制MDM2可以上调p53功能，达到抗癌作用。2004年，Vassilev等人报道了第一类MDM2小分子抑制剂，其有一个1,2,4,5-四取代-4,5-Z-咪唑啉母核，称为Nutlins，是一种很有前途的非肽MDM2小分子抑制剂（RG7112）。获得Nutlins晶体结构后，通过模拟重要氨基酸残基的相互作用，显示顺式咪唑啉可与MDM2的p53结合位点结合。由于其疏水性，Trp23，Phe19和Leu26非常吻合MDM2的疏水性口袋。Nutlins结合在空间上抑制了MDM2上的p53结合口袋，从而诱导p53积累并恢复其转录活性，随后在过表达MDM2的肿瘤细胞中发生凋亡。Nutlins化合物提高了p53稳定性，诱导p21靶基因表达，进而导致细胞周期停滞和凋亡。

另一类抑制p53-MDM2位点相互作用的小分子抑制剂是1,4-苯并二氮杂-2,5-二酮（BDP）类化合物。大量实验表明，BDP与MDM2之间存在相互作用，具有与p53三联体基序类似的构象，通过三个苯环与MDM2结合进而发挥抑制MDM2与p53结合的作用。[65]Spirulina ruthenium也可p53-MDM2相互作用，此类的羟吲哚环模拟p53的Trp23的侧链，这对与MDM2结合至关重要。疏水取代的螺吡咯烷环模拟Phe19和Leu26的侧链。广泛的晶体结构分析表明，Leu 22对于p53和MDM2的结合也很关键，表明氧化铈衍生物也具有活性潜力。[66]APG-115化合物43对MDM2具有高亲和力（Ki <1 nM），以低纳摩尔IC50值抑制细胞生长，并具有出色的口服药代动力学特征。APG-115还显示出对缺失p53的人类癌细胞系具有出色的细胞选择性。[67]异喹啉酮和哌啶酮也可用作MDM2和MDMX抑制剂。已经有报道以吡咯烷酮为核的MDM2抑制剂，咪唑并吡啶衍生物52对MDM2和MDMX表现出良好的抑制活性，IC50值为0.17 mM和0.468 mM。

5.3. MDMX抑制剂

MDMX（又称MDM4）和MDM2一样也是p53下游靶基因，也是内源性的p53抑制因子。MDMX分子结构比MDM2小，不具有E3泛素连接酶活性。但是MDMX通过与MDM2形成异源二聚体间接调节p53的稳定性，MDM2-MDMX可以泛素化p53进而介导其被蛋白酶体降解。MDMX的p53结合结构域与p53 TAD结合还可以抑制p53的转录调节活性。[18]

大多数MDM2抑制剂对MDMX的过度表达具有有限的抑制作用，并且大多数小分子抑制剂通过与MDM2的N末端口袋结合，以与Nutlins-3a相同的方式起作用。从而抑制其与p53的结合。尽管MDMX和MDM2与结合p53的N末端结构域相似，但是许多小分子以比MDMX更强的亲和力与MDM2结合。[68]SJ-17255是MDMX的第一种小分子抑制剂，竞争结合到MDMX wide-type p53肽上，EC50约为5 mM，可以导致成视网膜细胞瘤细胞中p53依赖性细胞死亡，与MDM2抑制剂联合使用的效果得到增强。Wang等人通过高通量筛选策略筛选了三种抑制MDMX表达的小分子NSC207895、NSC146109和NSC25485，并证明了NSC207895以剂量依赖的方式降低了MDMX启动子的活性，表明该小分子可能通过抑制MDMX转录而抑制了MDMX的表达。在这项研究中，作者发现NSC207895抑制了MDMX的表达，不仅增强了p53的转录活性，而且还防止了p53的降解。

图6：在临床试验中靶向p53和/或MDM2的代表性小分子

5.4. 临床试验阶段药物

根据药渡数据库，截至2023年3月，已有15款靶向p53MDM2 / MDMX的药物进入临床试验阶段，均为I期或II期临床，尚无进入III期临床试验的靶向疗法。其中，APR-246已经有五项临床试验在探索之中，并涉及多种类型的肿瘤。NVP-CGM097和COTI-2均处于临床I期试验。[69]在临床试验中有七种靶向MDM2的化合物，值得注意的是，RG7388是一种非遗传毒性的口服p53激活剂，它是III期难治性/复发性AML的选择性小分子MDM2拮抗剂（NCT02545283）。 RG7388的药代动力学特性有低清除率，半衰期为一天和剂量比例的特征。[70]DS-3032b已招募了四项临床试验，可破坏肿瘤细胞中的MDM2-p53相互作用，并正在开发为基于p53激活机制的癌症治疗药物。RG7112是第一个设计用于占据MDM2 p53结合口袋的临床小分子MDM2抑制剂。SAR405838[71]，AMG-232，APG-115和HDM201[72]正在I期临床试验中进行抗癌治疗。（图6）不幸的是，目前还没有靶向p53-MDM2 / MDMX的临床药物上市。

图7：靶向p53和/或MDM2的药物临床进展（2023.03.23）

【说明】P53/TP53（P字母大写，代表基因）；p53（p字母小写，代表蛋白）。

传奇的抑癌基因P53的历经40年从“恶魔”逆转成为了“天使”，作为细胞内重要的应激与调控枢纽对维持细胞的稳定抑制细胞癌变至关重要。可以看到随着科学研究的深入p53的功能越来越复杂，从经典的诱导细胞凋亡、DNA损伤修复、细胞周期阻滞不断扩展出很多新的非经典功能，在维持组织稳态和机体存活有关的生理过程中发挥着重要作用。除此之外，p53功能在基因、转录、翻译、翻译后各个层级的调控网络错综复杂，本文涉及到的PTMs只是冰山一角，还有很多未阐述的与等待进一步挖掘的机制。p53通过GOF突变得到的mtp53摇身一变成为了致癌蛋白这也是为什么P53在很长一段时间内被认为是一个原癌基因，了解GOF mtp53并设计靶向突变基因的药物，使其恢复正常的生理功能是一种很有临床潜力的药物设计思路。目前有很多靶向靶向p53MDM2 / MDMX的小分子化合物处于临床试验阶段，希望不久的将来能有药物成功上市，为癌症患者带来福音。

文章来源于公众号“医药学术”