核酸探針已被應用於分子診斷中，以確定臨床樣本（例如，純化的、原位的細胞和組織，或在固相中）和擴增後（主要在常規PCR中）的互補靶點。在80年代，Southern blotting法被用作PCR後的一個步驟，用互補探針確認擴增物的序列。

實時PCR（qPCR）的引入是分子診斷領域的一場革命。在擴增過程中，通過特定的探針識別擴增物，逐漸成為診斷中大量應用的金標準。探針不僅能確認擴增物的身份，而且還能進行定量分析。此外，特殊探針可用於分析擴增物的熔點。

1、用於實時PCR的探針

1.1、水解探針（「淬火」）

水解探針優先設計在離退火引物3′端3-10個堿基的位置。在探針的5'端，一個熒光色素被連接到C、A或T（由於固有的猝滅特性，從來沒有連接到G），作為標簽（大多數是FITC的衍生物）。此外，探針的3'端連接有一個猝滅劑。空間劑允許猝滅劑和熒光色素相互靠近，這是由它們的物理化學特性所決定的。它們的分子軌道可以相互作用，並發生猝滅（見圖1）。

圖1 | 熒光的猝滅

a 在猝滅過程中，受激電子的能量在回到其地相時不會透光，而是轉移到另一個熒光體上。當猝滅劑（Q）和受體/熒光劑（F）在其附近（0.1納米）時，猝滅是最有效的，這取決於F/Q的組合以及猝滅劑吸收和報告基團/熒光劑的發射之間的高度光譜重疊。

b 在大多數形式的猝滅中，主要是發生所謂的FRET猝滅。由於幾種弱的非共價相互作用，F和Q會在對方附近出現，也稱為碰撞猝滅。當兩者處於正確的方向和相互之間的距離時就會發生猝滅。F和Q之間的強疏水芳香基團在其他F和Q的組合中出現，如支持信標結構（也見圖4）。此外，這兩個分子之間的靜態耦合和變化的吸收光譜也會發生，這被稱為：靜態猝滅（這種相互作用對溫度和溶劑更敏感）。在實踐中，這兩種形式的組合經常出現。作為比較，兩個後續分子之間的距離是0.34納米。10個核苷酸之間的距離正好是34埃（dsDNA的螺旋結構中的一個扭曲）。

自由的、未結合的探針分子不顯示熒光（圖2）。水解探針（Tm值比引物高約10℃，最好是富含GC，但與序列的其他部分相協調）與變性靶點雜交的親和力比引物高（也更快）。這樣，探針在引物開始延伸之前就被結合瞭。

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圖2 | 用水解探針猝滅

一旦帶有分離核苷酸的熒光標簽在自由溶液中釋放，就會開始發出熒光。猝滅劑也處於隔離狀態，但與熒光色素的距離太大，無法猝滅熒光

a 5′-氟色素（F）、MGB（三肽）、猝滅劑（Q）和間隔物的分子組織都在寡聚物的3′端。圖2b中概述瞭連接體。

b 連接在連接體上的熒光色素（F）的分子組織，通過在寡核苷酸的5′端加入胞嘧啶-dUTP。

c 實時PCR中5′-核酸酶活性的原理。靶點變性後，引物和水解探針都會與其中一條DNA鏈雜交。探針的設計方式是使其比引物更快速有效地雜交。探針必須對擴增物有很高的特異性。探針的位置在靶點的5′端附近。水解探針在溶液中，由於附著在探針上的非熒光猝滅劑（Q）的猝滅作用，不會自動發亮。一旦寡核苷酸與靶點序列完全退火，DNA的合成就從引物（和探針）的3′端開始。當酶遇到水解探針時，聚合酶的5′-3′-外切酶域將變得活躍，並逐個堿基地去除探針。在這個過程中，DNA的合成繼續進行。

在DNA合成過程中，DNA聚合酶到達雜交的探針。當遇到探針-靶點雜交體的雙鏈結構時，酶會逐步水解探針，水解3′-5′-糖-磷酸鹽共價鍵。

這樣，一個又一個的核苷酸被5′-3′-核酸酶活性釋放成可溶性的核苷酸單磷酸酯。第一個被水解的核苷酸是5′-末端的氟鉻單核苷酸復合物。一旦後者被釋放到溶液中，就會失去與猝滅劑的接觸，氟色素就會重新獲得其熒光特性（見圖1）。當DNA聚合酶水解第一個核苷酸時，探針的Tm值就會大大降低，以至於當它等於Ta時就會自發解離。水解探針的一種特殊形式是短MGB探針（見圖3a）。

圖3 | 小溝結合（MGB）

a MGB是一種二氫環吡咯三肽，對DNA分子的小溝有特殊的親和力。它增強瞭引物或探針的雜交能力。這樣，隻使用瞭普通數量的核苷酸的一半。

b中概述瞭傳統探針和MGB探針的雜交和隨後的融化過程。靶點的大小是27bp，5′端第5位有錯配（綠色野生型，藍色T/C錯配）。很明顯，與傳統探針相比，短的MGB探針具有更高的區分突變異和野生型的能力。

1.2、分子信標

分子信標是一個探針，它被組織成一個莖環結構的發夾。猝滅劑和熒光色素與探針之間有一個間隔，分別位於寡核苷酸的3′和5′端部，其相互作用方式與上述水解探針相同（圖4）。

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圖4 | 分子信標

分子信標的主要結構和示意圖顯示瞭熒光劑（F：EDANS）和猝滅劑（Q：DABCYL）。BHQ和Cy3的結構式。

a 分子信標的例子。分子的3′和5′側的垂直線表示互補發夾區。

b 經典的分子信標。間隔物在寡核苷酸的5′或3′端一側耦合，另一側是熒光染料（F）或猝滅劑（Q）。間隔物由一定長度的碳水化合物組成，以獲得彼此之間的緊密接觸，達到最佳的猝滅效果。

c 分子信標的示意性概述。用於靶點雜交的互補堿基形成一個環形結構（發夾）。

d 帶有額外核苷酸間隔物的熒光色素的位置概述，以改變FAM或TAMRA與BHQ猝滅劑的位置。

靶點特異性部分位於環路，而5-7個非特異性的、處於高Tm的雙鏈構象的互補性（特別是G/C）堿基，形成莖。3′端不能有「G」，環的Tm必須高於Ta 7-10℃。一旦設計出一個環，就可以填入特定的、獨特的探針序列的變異。在非過飽和條件下，環路是穩定的，信標不會發出熒光。隻有在PCR變性步驟中，環才會解離成一個開放的線圈結構。考慮到所有的雜交都是動態過程，信標與擴增物的雜交發生在冷卻到Ta的過程中，並且由於其較高的Tm而先於引物的雜交發生。隻有信標的特定部分會與靶點序列結合。

因此，它的5′端和3′端帶有猝滅劑和熒光色素，將被物理分離，猝滅將被停止，熒光可以被檢測到。所有未雜交的信標在這期間將重新獲得莖環結構。因此，必須在退火階段結束時測量熒光，3步循環方案是必須的。當聚合酶在延伸階段到達雜交信標時，它將解離。

目前還不完全清楚信標是通過何種機制解離的。然而，它必須保持完整，因為在qPCR過程中，表明遊離的氟色素的背景熒光不會增加。據推測，當溫度上升到72℃，信標與靶點模板解離時，熱力學特性會使信標處於原來的環狀結構。

1.3、「雙」探針（增強版）

需要兩個在相鄰的3′和5′端核苷酸上用供體和受體的熒光色素標記的探針。這些探針將在擴增的靶點上「頭對頭」雜交。供體和受體相互靠近，從而產生熒光（FRET：「福斯特共振能量轉移」）（見圖5a）。

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圖5 | 傅氏共振能量轉移（FRET）

兩個氟色體和激發電子之間的能量轉移參與瞭FRET。 a 首先，一個供體（D）氟色體被激發。然而，第二個氟色素，允許FRET，阻止受激電子正常返回到與光的發射有關的基態。相反，供體（D）的激發電子無輻射地返回到基態，而它的高能量含量則被轉移到第二個受體氟色素上，其中的電子反過來成為激發電子。兩個熒光體的特定組合導致熒光的轉移或信號的猝滅。

b, c, d 顯示瞭FRET在雙探針（b）、分子信標（c）和水解探針（d）的應用。

註：受體熒光劑（A）的熒光。供體（D）將其輻射能量轉移到受體（A）上。受體會變成熒光（A），但隻有當帶有供體或受體的兩個探針串聯雜交時才會這樣做。供體（F）將其輻射能量轉移到受體（Q）上。猝滅體Q吸收瞭激發能量，一個電子將被激發。這個電子也會返回到它的基態，而不發射光，隻要淬體（Q）和熒光劑（F）保持在彼此的附近，就不會觀察到熒光。一旦F和Q發生物理分離，能量轉移就不再可能，F將發出熒光。

這種技術也被稱為「雙雜交」（圖6）。雙重雜交經常用於高分辨率的熔點分析。

圖6 | 雙探針雜交（特定化學反應）

用引物和頭對尾的探針雜交的擴增物示意圖（錨式雜交）。來源 不可追溯的來源（重新繪制）

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