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疏水相互作用色譜 (HIC) 是一種蛋白質分離、純化和表征的傳統技術。隨著抗體偶聯藥物 (ADC) 的不斷發展，HIC 在ADC 表征和分析上應用越來越廣泛。與其他技術不同，HIC 允許蛋白質在保持天然結構和活性的溫和非變性條件下進行分析。這一點非常重要，為HIC後續的研究提供瞭條件。接下來，我們以一個傳統的高效液相儀配合使用硫酸銨緩沖液為例，為大傢闡述HIC的關鍵參數。並對方法優化註意事項進行瞭總結。

簡介

HIC的方法最早由Tiselius提出，他稱此技術為"蛋白質鹽析"。然而，實際的 HIC 術語後來由 Hjerten 創造，他描述此過程為在固體基質上，蛋白質的結合和洗脫蛋分離過程。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動相多采用高濃度鹽緩沖液進行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由於固定相較強的疏水性和有機流動相引起蛋白質的不可逆吸附和變性，因此特別適用於活性物質的分離與純化。疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質分子在這樣的固定相和流動相中進行分配，蛋白質分子上的疏水性基團和固定相的疏水基團作用而被保留。當用流動相洗脫時逐漸降低流動相的離子強度，洗脫能力增強。利用被分離組分分子表面的疏水微區、（可逆）變性後暴露出的疏水殘基，或在高鹽環境下暴露於分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強弱，依次用從高至低離子強度洗脫液可將疏水作用由弱到強的組分分離開。蛋白質分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質不會失活。高濃度鹽與水分子發生強烈作用，導致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進疏水性分子與介質的疏水配基之間發生結合。這種疏水作用的大小取決於固定相和溶質的極性、流動相的組成和濃度。由於各種蛋白質表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過改變固定相的極性和流動相的組成使蛋白質得到分離。

圖1.HIC原理示意圖

ADC 細胞毒劑（有效載荷）必須穿過脂質膜以抑制 DNA 復制、蛋白質合成、酶促活動或細胞分裂。要穿過膜，有效載荷必須是親油的，因此在性質上是疏水的。有效載荷與抗體的連接增加瞭疏水性，這種變化可以通過 HIC 檢測。載荷的數量與疏水性和滯留時間成正比。而且，疏水載荷越多，保留時間越長。通過疏水性差異分離各藥物種類，並對各種類進行定量分析，是HIC分析ADC的基礎。

HIC可以和RP、MS等聯用來分析ADC偶聯情況。HIC必須與MS聯用才能確認藥物與抗體偶聯比（DAR），因為峰值保留時間的變化不會直接顯示藥物偶聯的程度。但是，如果每個峰的偶聯情況確定瞭，HIC可以很快並準確確定每種藥物的比率。因此，HIC用於質量評價和反應監測的主要方法，由於分離過程的溫和性，可以用於分析具有酸不穩定連接的ADC。

HIC分析也用於候選藥物的選擇，以盡量減少由於非特異性相互作用而引起的體外和體內毒性。疏水分子往往更容易通過非特異性結合與細胞膜的脂質雙分子層結合，並可能導致不必要的毒性。在HIC分析中，由於疏水性與保留時間成正比，因此通常根據保留時間和疏水性對藥物進行篩選。ADC候選藥物的選擇主要考慮療效和HIC疏水性傾向等指標。

使用Tris-HCl為基礎的緩沖液以線性梯度從色譜柱中洗脫蛋白質，有利於不同疏水物質的分離。DAR是通過比較每個峰值的相對量和載荷的共軛程度來確定的（通過峰面積百分比和偶聯藥物個數計算加權平均DAR）。與用於ADC分析和表征的其他技術相比，HIC提供瞭一種獨特、快速的分析方法，具有幾個優點。如質譜、反相和親水性相互作用色譜(HILIC)依賴有機溶劑作為流動相，低或高pH值，高溫等，都有可能使ADC變性。而且針對ADC來優化這些方法從而解決這些問題又是非常耗時的。HIC分離得到的ADC組分保持活性，可用於療效研究。HIC不能應用於一些親水載荷。而且，非常疏水的有效載荷可能需要大量的方法開發。HIC必須與質譜相聯才能進行各峰的鑒定，才能準確計算DAR，否則，就必須對藥物負荷峰值進行假設。對於ADC的疏水性排序，HIC分析是最合適的，因為柱結合是由蛋白質的疏水性驅動的，而疏水性與保留時間成正比。HIC方法的優化沒有通用的規則，針對不同的樣品有不同的方法。本文所描述的方法利用常用的硫酸銨緩沖體系和丁基柱對ADC進行表征、排序和分析，是開發優化HIC方法基礎。

下面以一個具體的例子為大傢詳細闡述HIC在ADC上的應用。此方法可以套用與不同的ADC，同時，也可以在此基礎上進行優化。

材料

在制備和處理ADC樣品時，應註意個人防護，建議使用雙丁腈手套和袖護套，以防止暴露。試劑均為液相色譜級。所有設備和消耗品都有適當的標簽，以傳達潛在的危險。

緩沖液

流動相A: 25mm Tris-HCl, 1.5M硫酸銨，pH 8.0

稱取198.2 g硫酸銨，加700ml超純水溶解，加入25 mL 1 M Tris HCl(pH8.0)，用0.1 M氫氧化鈉調節pH值至8.0。用超純水定容至1L，0.2μM濾膜過濾。

流動相B: 25mm Tris-HCl(pH8.0)，5%異丙醇

取25ml 1MTris HCl(pH8.0)於燒杯中，加925ml超純水和50ml的異丙醇。0.2μM濾膜過濾。

色譜柱

無孔TSKgel Butyl-NPR色譜柱（TOSOH Bioscience）:4.6 μm ID *3.5 cm, 粒徑2.5μM。

樣品準備

抗體和ADC用1x PBS pH 7.2 稀釋至1 mg/mL ，0.2 μM濾頭過濾。

設備

安捷倫1290 Infinity UHPLC，四元泵，1200系列高性能自動采樣器，二極管陣列檢測器，分數收集器，Open Lab軟件。

方法

1.在280nm和214nm處讀取吸光度，峰值寬度為0.2分鐘(4 s響應時間)(1.25 Hz)；

2.0.8ml/min，室溫，進樣量50ug；

3.流動相梯度如下：

3393db470acae21f23409c83b741ec6b

積分事件表

數據處理

圖2.HIC分析ADC的典型圖譜。(a)完整的色譜圖，有溶劑峰、洗脫峰和由於硫酸銨緩沖液導致的基線偏移。(b)放大顯示峰形的色譜圖

圖3和圖4為隨機偶聯和定點偶聯圖譜，DAR是通過比較每個峰值的相對量和載荷的共軛程度來確定的（通過峰面積百分比和偶聯藥物個數計算加權平均DAR）。

圖3.鉸鏈半胱氨酸隨機偶聯ADC的HIC圖譜。ADC(紅色)和未偶聯抗體(藍色)。每個峰的藥物載量由星星的數量表示。圖4.半胱氨酸位點特異性偶聯ADC的HIC圖譜。ADC(紅色)和未偶聯抗體(藍色)。每個峰的藥物載量由星星的數量表示。平均每個抗體的DAR為3.8個藥物。

以下圖5為例具體計算DAR值

7c8e52592ab811a14340af5c4c344c6f圖5.每個峰的面積百分比及對應的DAR值

大傢可以參考上述HIC分析ADC的方法，對ADC的疏水性、DAR值等進行表征，以上面的方法為基礎，通過優化方法，開發出適合自己產品的方法。

下面為大傢總結一些HIC在ADC分析表征應用中需要註意的問題。幹貨，強烈建議收藏。有問題也可以隨時私信小編，我們一起探討。

1.註意硫酸銨的儲存及使用有效期，一般室溫密閉條件下可以保存1個月。用時用0.2um濾膜過濾，註意觀察是否有結晶析出。

2.有效載荷在本質上是疏水性的。疏水性越強，保持時間越長。非常疏水的有效載荷可能會影響ADC峰的形狀和洗脫，可能需要有機修飾劑來實現完全柱洗脫。對於疏水性非常強的載荷，當優化HIC方法時，應考慮非支鏈和較短側鏈的色譜柱。

3.提高流動相緩沖液的pH值有助於提高抗體和ADC的柱結合，而降低pH有助於蛋白質的洗脫。大多數抗體的等電點在7和9之間。因此，當緩沖液的pH值接近pI時，會減少凈表面電荷，並可能促進與柱的相互作用。相反，降低緩沖液的pH值，遠離pI，將增加凈表面電荷，可能有助於蛋白質洗脫。然而，緩沖液pH值的變化對ADC結合和洗脫的影響是不可預測的，取決於樹脂類型、緩沖鹽和樣品。

4.不與HIC柱結合的樣品會流穿，與溶劑峰一起洗脫，導致溶劑峰強度增加。將硫酸銨濃度提高到2 M，並將pH值調整到更接近ADC pI的位置是改善結合的策略。然而，對於某些adc來說，色譜柱可能就需要具有更長的鏈或更多非極性基團。

5.HIC一般不會出現回收率差的問題。ADC沒有註入到HIC色譜柱經常會被誤解為沒有從色譜柱洗脫，而實際上是由於ADC從一開始就沒有進入到色譜柱上。因此，重要的是要驗證ADC是否吸附在色譜柱，以及儀器是否正常工作。同時，確保溶劑峰值強度不升高。當ADC不能洗脫時，可在流動相B中加入有機改進劑，如異丙醇或乙腈（15%，v/v），以促進ADC從柱基質中釋放，然而，應避免蛋白鹽析或者變性。在流動相aA中不應使用有機修飾劑。這些修飾劑通過直接競爭與色譜柱的結合，並通過增加流動相的表面張力來幫助洗脫蛋白，從而減少疏水相互作用。因此，向流動A中添加修飾劑會增加蛋白不與色譜柱結合的可能性。如果使用其他色譜柱，首先確保未偶聯的抗體結合並在梯度25%以前被洗脫。

6.經典共軛ADC的一般方法通常無法實現峰基線分離;而對於更均勻的位點特異性共軛ADC，則得到瞭較好的結果，分別見圖3和圖4。為瞭達到良好的峰分離，需要對方法進行優化。優化需要考慮流速、梯度、HIC柱和流動相組成。由於分子的復雜性，優化HIC方法通常與未偶聯ADC有一定差異。

7.峰的分離是數據分析中需要檢查的另一個重要參數。預期峰的數量應該反映在圖譜中。缺少峰值或增加峰值對DAR計算都是有影響的。因此，質譜分析需要突出偶聯藥物的數量和每個峰的載藥量，以確定峰分離方法的充分性。當考慮到這一點時，可以通過延長梯度來改善峰分離。

8.梯度優化可以改善峰的形狀和峰的分離，以提高數據的準確性。一般來說，增加梯度的長度可以改善峰的分離和形狀。由於ADC的復雜性，梯度優化參數必須通過實驗確定。梯度選擇依賴於流動相、流速和色譜柱。使用硫酸銨緩沖液的洗脫梯度較短，但使用其他緩沖鹽時必須延長梯度。

9.丁基樹脂是HIC柱最廣泛使用的樹脂，由於樹脂鏈長，具有中等的結合傾向。典型的HIC柱具有線性的烷烴鏈或簡單的芳香基團，並可以通過分支進一步修飾。不同廠傢的丁基色譜柱可能會有不同的差異，從而影響結合、峰分離和洗脫。使用具有更長或更多支鏈的色譜柱可以增強樣品的結合和保留。樹脂的結合能力取決於鏈的長度，鏈越短，結合能力越弱，反之亦然。一些常見的樹脂，按鏈長從低到高和結合能力的順序為:甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

10.樣品純度是HIC分析成功的關鍵。所有樣本都應過濾，去除遊離載荷和聚合，以確保獲得準確的數據。對於小規模的偶聯物，ADC可以使用緩沖交換柱進行純化;對於大規模的制劑，ADC可以使用陶粒羥基磷灰石色譜或切向流過濾進行純化，以去除或最小化自由載荷污染物和聚集物。自由載荷，特別是那些非常疏水的載荷，也會與HIC柱結合，這可能會使數據解釋復雜化(如圖6所示)。蛋白質聚集物往往更疏水，並將與單體分離，從而形成單獨的峰。由於峰的識別對於準確的數據解釋至關重要，所以應該盡一切努力消除由於聚集物和遊離藥物等人為因素造成的峰。

6eeb458707ee56fe37cd4b8bb710222f圖6.ADC自由載荷去除前後的HIC色譜圖。藍色比較未偶聯抗體，紅色表示ADC自由載荷去除前，綠色表示ADC自由載荷去除後。

11.進樣體積請勿超過100 μL，否則ADC可能無法與柱結合。該方法旨在最小化樣品制備。如果進樣體積大，則樣品緩沖界面的鹽濃度過低，導致ADC不會被柱吸附。為瞭克服這個問題，可以在樣品中加入體積比不超過50%的流動相A。同時要避免流動相A直接加入到樣品中可能引起蛋白沉淀。

12.註意溶劑峰的保留時間，如果保留時間有漂移，可能是鹽的沉積堵塞管路，需清洗設備。記錄柱安裝後的初始儀表背壓。背壓的增加會影響結果。在樣品運行前後，用50毫升水沖洗HPLC，清除儀器上的殘留鹽，以防止堵塞或限制流動。銨鹽可能在儀器內沉淀，導致樣品結合和回收率差、保留時間偏移、樣品洗脫不完全，影響方法優化、數據解釋和故障排除。

13.柱溫對樣品的吸附和洗脫影響很小，但會影響峰型。柱溫最好不要超過30℃，否則會使蛋白變性。柱溫優化應該放在最後。

14.在A280nm處監測洗脫峰時，硫酸銨緩沖液通過梯度洗脫會導致基線輕微偏移。然而，可以使用使信號與噪聲之比最大化的任何吸收波長。在某些情況下，附加有效載荷後，可以在一個特有的波長下區分共軛峰與非共軛峰。例如，在330 nm下對吡咯苯並二氮雜卓偶聯ADC進行檢測，隻能檢測到偶聯的峰。

15.峰的積分是DAR計算的必要條件，良好的峰形對計算精度有重要意義。峰值形狀主要受色譜柱和梯度的影響。如果峰太寬或太窄，峰的準確積分會受到影響。延長梯度可以改善窄峰的形狀，縮短梯度有助於寬峰的形狀。隻有為瞭保證積分精度，才能改變峰的形狀。改變流動相組成，例如，使用乙酸銨緩沖液或不同的色譜柱，可能會改善峰型。

16.具有非疏水或親水載荷的adc可能不具有典型的洗脫峰。這些ADC能以較短的保留時間洗脫或與裸抗共洗脫，如果ADC和未偶聯抗體保留時間相同，則不能使用HIC進行分析和表征。

17.共軛位點影響峰的形狀和洗脫峰的數量。迄今為止，所有已批準的ADC均使用賴氨酸或鉸鏈半胱氨酸的隨機偶聯方法。這種偶聯方法產生多個峰，對應於藥物負載的程度，分析起來可能很復雜(圖2)。另外，臨床試驗中的幾個ADC是位點特異性偶聯到一個或多個工程位點。這些位點特異性ADC一般都是均勻的，用HIC分析時產生一個單峰，比隨機共軛的adc疏水性更低。與隨機偶聯的ADC相比，一些位點特異性的偶聯位點可以最大限度地減少負載的暴露，從而減少疏水性和保留時間。

18.記錄初始溶劑峰值強度。溶劑峰強度的增加表明樣品結合不完全。溶劑峰強度對排除ADC結合問題非常有用。在方法優化過程中，當測試柱或流動相時，跟蹤溶劑峰值強度是非常有用的。

圖7.種裸抗ADC的疏水性排序HIC圖譜。抗體F疏水性最小，抗體C疏水性最強

19.在對抗體和ADC進行疏水性排序時，應具有合適大的樣品濃度和緩沖液。由於疏水性和脫靶毒性之間的聯系，基於疏水性的藥物候選排序是重要的。圖7顯示瞭針對相同腫瘤特異性抗原的6個抗體的HIC分析，這些抗體是ADC候選藥物。在這種情況下，mAb-A疏水性最小。在對ADC進行疏水性排名分析時，抗體、偶聯位點、偶聯方法和負載都會影響保留時間。

以上內容就是HIC在ADC分析表征中的應用，同時總結瞭一些註意事項以供大傢參考。由於ADC結構的復雜性，很難找到一個通用的HIC方法應用與所有的ADC表征分析。但是，大傢可以借鑒本文提供的特例及研究思路，優化出一款適合自己ADC產品分析表征的HIC方法。

參考文獻

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