原創 雲裡有星 圖靈基因 2023-07-16 10:13 發表於上海

撰文：雲裡有星IF=25.476推薦度：⭐⭐⭐⭐⭐亮點： 1、含在各種亞克隆間預存在的表觀遺傳譜和趨集適應模式的耐藥機制的平行發生。2、亞克隆特異的骨髓瘤和骨髓微環境細胞間的相互作用。

近日，德國海德堡大學醫院的Marc S. Raab 等人團隊在《Blood》雜志上發表瞭名為“Resolving therapy resistance mechanisms in multiple myeloma by multi‐omics subclone analysis”的文章。腫瘤內異質性往往隨具有多種藥物抗性的亞克隆累積在多線治療後變得最為明顯。為解決這一挑戰，在亞克隆水平表征抗性的機制是辨別常見缺陷的關鍵。本文中，作者為定義由15例復發/難治性骨髓瘤(RRMM)組成的縱向樣本的亞克隆結構和進化整合瞭全基因組測序、單細胞轉錄組學(scRNA‐seq)和染色質可及性(scATAC‐seq)以及線粒體DNA(mtDNA)突變。作者評估瞭轉錄組和表觀組的變化以解決治療抗性的多因素本征，並將其與不同機制的伴行發生聯系起來：(i)與生存優勢相關的預先存在的亞克隆表觀遺傳譜，(ii)遺傳學顯著不同的亞克隆的趨集表型適應，和(iii)亞克隆特異的骨髓瘤和骨髓微環境細胞間的相互作用，展示瞭綜合多組學分析如何用於隨時間追蹤和表征顯著不同的的抗性克隆，以識別針對其的分子靶標。

第一部分 背景介紹Part One ──────────────────

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瘤內異質性與其在治療中的適應和進化是治療抵抗的主要來源，范例疾病是多發性骨髓瘤(MM)，特點為骨髓(BM)中惡性漿細胞的克隆擴增。各種耐藥機制積聚時，MM的瘤內異質性是一個在多線治療過程中變得最明顯的臨床挑戰。隨著為嚴重預治療的復發/難治性MM (RRMM)近期引入瞭新型靶向免疫治療，識別不同的抗多藥的亞克隆的常見缺陷成為該領域迫切的未被滿足的需求。

為實現這一目標，MM亞克隆已由來自拷貝數變異(CNAs)分析的單細胞RNA測序(scRNA - seq)和轉錄聚類定義。此外，選自單細胞染色體可及性(scATAC‐seq)數據的線粒體DNA突變已被用於剖析和追蹤其他血液系惡性腫瘤的亞克隆。同時，基因組、轉錄組或表觀遺傳學測序結果揭示瞭主導MM治療反應的分子機制。 此外，scRNA-seq方法提供瞭MM細胞和已被證實在疾病表型中必不可少的骨髓微環境(BME)相互作用的信息。然而，除瞭這些進展，解決多因素的治療抗性性質仍然具有挑挑戰性。近期研究基於基於單個讀數定義亞克隆，因此聚焦於分子抗性的個體角度。同樣地，在何程度上不同的抗性機制會一同出現在同樣的亞克隆中並在治療中變化仍不清楚。

第二部分 結果解讀Part Two ──────────────────

1、WGS指導的單細胞多組學分析整合亞克隆的轉錄和表觀譜

先前研究強調瞭MM的治療相關的亞克隆動力學。然而，個體亞克隆對治療的反應和與BME的相互作用在很大程度上仍屬未知，盡管可為治療耐藥機制提供重要信息。因此，作者對15例RRMM患者的CD138+分選骨髓抽液進行瞭聯合WGS的基於液滴的scATAC-seq和scRNA-seq。為12/15例患者在挽救治療前(T1)和隨後復發時收集序列樣本，產生44,637和37,280個腫瘤細胞，行以上測序。隨克隆和亞克隆CNAs出現在幾乎所有MM患者中，作者進行瞭WGS引導的聚類策略以解析前述測序數據中的亞克隆結構。兩種sc-seq模式獲得的結果高度相關，從而將單個亞克隆的轉錄和表觀遺傳譜結合起來。

2、線粒體突變進一步描繪亞克隆結構

作者的最初方法是基於具有相同CNA譜的MM細胞屬於同一亞克隆的假設。接下來，作者探究瞭在MM中是否mtDNA突變可進一步剖析基於CNA的亞克隆的定義，因它們最近被提出能作為研究慢性淋巴細胞白血病(CLL)和急性髓系白血病(AML)的克隆動力學的可選方法。因此，作者在scATAC-seq數據中調用mtDNA突變，並在匹配的WGS中確認瞭各自變體的豐度。總體上，每個RRMM患者顯示出與眾不同的mtDNA突變譜(平均=6個突變，范圍1 - 14個突變)。與先前的報道一致，突變遵循等同於C>T和T>C的選擇中性和復制不對稱模式。

對於患者RRMM19，和為瞭體細胞核突變的基於WGS的癌癥克隆分數(CCF)，兩個mtDNA突變(15777G>A和3749T>C)分別在T1和T2的單細胞中顯著不經比較同地富集，支持兩個具有相同CNA譜的亞克隆，並進一步表明在MM中存在亞克隆定義的mtDNA突變。因此，作者接下來單獨比較瞭由mtDNA突變和最初基於CNA的評估定義的亞克隆。獨特的mtDNA被檢測於33%的CNA定義亞克隆(18/55)，表明僅mtDNA突變不足以解析RRMM的亞克隆結構。

通過結合CNAs和mtDNA突變，作者得以揭示亞克隆結構的進一步細節。患者RRMM15是這一發現的主要例子。該患者中，作者最初僅使用WGS引導的CNA方法鑒定瞭9個亞克隆。通過整合mtDNA突變信息，作者在scATA-seq數據中確定瞭另兩個亞克隆。這兩個亞克隆通過scATAC-seq中兩個世系定義mtDNA突變10114T>C和14769A>G(分支A)來區分，並分別在染色體1p和16q上描繪瞭獨特缺失。重要的是，這些最初未檢測到的CNAs也可以在測序數據中被分配到相應亞克隆。此外，作者檢測到在多個亞克隆中共同富集的mtDNA突變，這些突變同樣標記瞭亞克隆分支(例：亞克隆1和2中的15928G>A，亞克隆7和8中的15356G>A和12962G>A，亞克隆9、10和11中的13958G>A)，並使作者描繪克隆關系。攜帶著這些共同富集mtDNA突變的細胞在UMAP圖上隔離並標記瞭含為POUF5F1B,TCF3和IRF4 TF模體的分支特異的活動的不同種群，支持這些亞克隆的密切關系。

接下來作者評估是否可通過mtDNA突變來追蹤新出現的復發疾病，因此分析瞭來自在長達3899天的時間跨度內連續采樣的6位患者為腫瘤樣本的測序數據(圖2h，補充圖4a‐c)。在4/6例患者中檢測到包括RRMM富集突變的動態mtDNA突變(RRMM2/9/10/15)。值得註意的是，在這些患者中，RRMM富集突變可在T2前2464天被看到，然而它們都不能在基線被測得，表明一線治療或復發治療時暴露於馬法蘭（溶肉瘤素左旋體，一種抗MM藥）的單腫瘤細胞的克隆擴增。事實上，在研究中，所有具有RRMM富集mtDNA突變的患者都攜帶與暴露於馬法蘭密切相關的單堿基替換(SBS)-MM1突變特征。

綜上，作者的結果描述瞭當與基於CNA的亞克隆分配相結合時，mtDNA突變如何能最好地被應用為譜系標記。這種綜合方法產生瞭能有平均每個患者4個(范圍：1‐11)亞克隆的亞克隆結構的全面圖景，及匹配轉錄組和表觀基因組譜。在有配對樣本的患者中，分別有5例、4例和3例患者出現穩定進化、克隆選擇和分支進化，為研究後續章節中治療前後亞克隆的動態學提供基礎。

3、跨亞克隆的抗性機制的平行發生

確定瞭具有匹配轉錄和表觀遺傳譜的亞克隆後，作者接下來在具有呈現於時間點和被作者聯合的基於CNA和mtDNA分配定義的多個可識別的亞克隆的病人中，研究瞭治療對單個亞克隆的影響。在即使隻在單細胞水平有分支進化患者中，作者也無法在T1檢測到已新出現的亞克隆。因此，作者將重點放在具有穩定進化或克隆選擇模式的患者上，以隨時間變化比較亞克隆轉錄和表觀遺傳。

雖采用瞭異質治療方案，但這些患者仍出現共同的模式。作者發現，大多數治療引起的基因表達變化和TF基序活性在每個患者的亞克隆情況單個亞克隆中共享。這些趨同適應機制可以通過對已知兩種治療方法的抗性機制來說明：通過增加熱休克蛋白(HSP) 表達的蛋白酶體抑制和通過NFKB通路上調的MEK/BRAF抑制。在患者RRMM7中，如HSP90AA1的，被認為是耐藥驅動因子的幾種HSPs在兩個克隆中經卡非佐米治療中均顯著上調。與這一發現相一致的是，包括ZNF384、IRF1和MEF2傢族成員的可結合上調的HSPs46的啟動子的TF基序，在兩個亞克隆中在治療後顯示出更高的活性。在使用MEK/BRAF抑制劑治療的RRMM3中，在兩個亞克隆均表現出NFKB通路基因的顯著上調。這被兩個亞克隆中NFKB基序對MEK/BRAF抑制活性的顯著提高所證實。BRAF/MEK聯合抑制已被證明可引起更多臨床反應。

因此，我們分析瞭屬於該治療組的另一名患者，其克隆組成發生瞭重大變化(RRMM9)。與RRMM3類似，30% (11/37)MEK/BRAF抑制治療後上調的基因是NFKB通路的部分，包括BCMA (TNFRSF17)51、CD79A48、49和BTG250。對於RRMM9，隻有四分之一亞克隆在治療後仍然可檢測到。該亞克隆在T1時表現出所有亞克隆中最高的NFKB傢族成員基序活性。因此，作者得出結論，獨立於亞克隆組成，治療抗性可通過所有亞克隆的趨同表型適應或預先存在的，不必需被治療誘導的的表觀遺傳譜來介導，這強調瞭在單個亞克隆水平上評估MM的重要性，以及多組學分析對理解轉錄和表觀遺傳特征在治療介導的耐藥中的作用的功用。

4、差異處理反應與亞克隆特異性BME相互作用有關

基於觀察到亞克隆組分可能是差異的治療反應的基礎，我們接下來考慮瞭其他亞克隆結構可見治療誘導變化的患者。特別地，作者發現患者RRMM6的MCL-1抑制引起具有雙等位基因TP53畸變的亞克隆的耗盡。為解決這種耗竭的分子機制，作者首先探索瞭靶點的潛在亞克隆改變。作者檢測瞭兩個主要亞克隆間(亞克隆1與亞克隆2)在MCL-1位點共可及性上的差異，然而，這些差異並未致顯著的MCL-1表達變化。

作者接下來評估瞭是否TP53畸變直接影響對MCL-1誘導的細胞毒的細胞弱點。因此，將基因工程雙等位基因TP53 del/mut (R175H)52、53和wt/wt AM-1細胞系體外暴露於不同劑量的MCL-1抑制劑。與RRMM6研究結果所表明的相反，雙等位基因TP53 AMO-1細胞系與野生型細胞系相比較不敏感。因此，TP53的失活似乎並不是RRMM6中亞克隆1缺失的基礎。

接下來，作者轉向兩個主要亞克隆之間的轉錄差異。在T1時兩個主要亞克隆之間差異表達最高的基因覆蓋瞭幾個表面標記。其中，CD44已被報道是一個細胞粘附介導耐藥(CAM - DR)的關鍵分子，且是腫瘤-BME相互作用的已知媒介。與差異基因表達分析一致，scATAC -seq數據的共可及性分析顯示CD44啟動子與亞克隆1的對亞克隆2在時間點T1缺失的遠端推定增強子元件之間存在很強相關性。因此，激活一個亞克隆而不激活另一個亞克隆中的增強子可導致觀察到的CD44表達的差異。為測試CD44高表達是否與雙等位基因TP53失活有關，作者對46例RRMM患者進行瞭大部的RNA測序。

作者發現，與TP53野生型和TP53突變患者相比，CD44表達在TP53雙等位基因突變患者顯著增加。作為功能驗證，作者轉向來自基因工程雙等位基因TP53 del/mut (R175H)和wt/wt AMO -1細胞系的公開的大量RNA-seq數據，發現具有未激活TP53的細胞的CD44基因表達較TP53wt細胞系明顯更高，Western blot也證實這一發現。CD44在T1時的高表達隨後在MCL-1抑制後下降，表明潛在的包括改變的亞克隆-BME相互作用的機制。事實上，CellChat在T1時通過CD44預測瞭亞克隆1與cDC2/ gmp /CD14+以及CD16+單核細胞之間的特異性相互作用。重要的是，這種各自的相互作用在MCL-1抑制時丟失。綜上，這些結果表明在具有不同治療反應的亞克隆之間，腫瘤-BME相互作用有差異。

5、跨亞克隆共享的BME相互作用提示潛在可行的治療靶點

上述發現使作者將互作預測擴展到每個時間點至少有兩個共存亞克隆和匹配BME scRNA-seq的所有患者(n=7)。這些患者中，CellChat預測平均有32個腫瘤和BME細胞之間的、有約20%未在每個患者所有亞克隆中預測的配體受體相互作用(范圍23 -45)。在患者隊列中，細胞間粘附分子(ICAM)信號網絡被發現介導瞭大多與BME的非共享相互作用。特別地，在5例患者中，骨髓瘤細胞上的ICAM2與BME細胞上的幾種整合素(ITGB2/ITGAL/ITGAM/ITGAX)之間的相互作用被預測具有亞克隆特異性。

此外，所有有縱向樣本的患者都顯示在時間點之間變化的相互作用(時間的改變)。例如，在患者RRMM15中，T2時的所有亞克隆都顯示出由ICAM1途徑介導的時間相互作用，而在T1時未檢測到。以ICAM1的單克隆抗體bersanlimab為形式的靶向ICAM-1免疫治療或CD38 x ICAM1雙特異性抗體已經在臨床試驗被測試(NCT01838369)，或已被建議用於MM和B細胞非霍奇金淋巴瘤。因此，作者在16例RRMM患者的擴展的主體RNA-seq數據集中進一步研究ICAM1的時間表達變化，發現ICAM1表達在T2時顯著上調，特別是在患者RRMM6和RRMM15中。

為進一步描述ICAM1表達增加的機制，作者在測序數據中評估瞭ICAM1位點的染色質可及性。作者觀察到在T2相較T1，細胞ICAM1啟動子區域具有更高的共可及性，表明治療誘導的更高ICAM1活性。此外，RRMM細胞在T2時也表現出更高的包括先前在MM發病機制中描述的包括IRF64-73、NFKB74-76和STAT77-79傢族成員的TF基序的可及性。在這些傢族中，IRF4、IRF1、RELA、STAT1和STAT2是已知的驅動ICAM1表達的TF。scATAC-seq數據得出的上調機制與有測序(ChIP - seq)分析的MM細胞系KMS12BM73的染色質免疫沉淀實驗結果一致。作者發現ICAM1啟動子峰與IRF4 ChIP-seq峰有重疊。這些正交數據集表明瞭由包括IRF4在內的TFs驅動的不同的ICAM1的表達。

第三部分 技術路線Part Three ──────────────────

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總體而言，作者觀察到所有患者亞克隆特異的隨治療變化的與BME細胞的相互作用。一些相互作用，如由ICAM1介導者，在給定時間點上在亞克隆之間共享，因此代表瞭亞克隆間的潛在的可操作的免疫治療靶點。

教授介紹

Prof. Dr. med. Marc-Steffen Raab，德國海德堡大學醫院骨髓瘤中心臨床負責人，血液腫瘤專傢。 Marc-Steffen Raab團隊主要關註多組學和免疫學層面改變對骨髓瘤預後和治療的影響，探索新靶點和標志物。

參考文獻Poos AM, et al. Resolving therapy resistance mechanisms in multiple myeloma by multi-omics subclone analysis. Blood. 2023 Jun 30:blood.2023019758. doi: 10.1182/blood.2023.019758. Epub ahead of print.>>>關於我們<<<

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