1．SOP18 間接ELISA法效價檢測抗血清效價

通過間接ELISA法來確定抗原最佳包被濃度 (方陣滴定，也叫棋盤滴定法) 。

以兔高免血清多抗效價檢測為例

1）抗原用包被緩沖液CBS (0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)按1μg/ml濃度用作連續1:2倍比稀釋，每個稀釋度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶標板中，覆膜密封（防止水分揮發）4包被過夜(12h以上)。

2）次日甩掉板中液體，在吸水紙上拍幹板子，每孔加入150μl封閉液(含2% BSA的包被緩沖液CBS），室溫（25） 2h以上。

3）用洗滌液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此時將待測高免陽性血清和空白陰性血清用抗體稀釋液（含1% BSA的PBS緩沖液,pH7.4）分別從1:500開始做連續1:2倍比稀釋，按下圖分佈模式100μl/孔，37 1h。

4）取出拍幹，洗滌液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗體稀釋液1:3000稀釋HRP標記羊抗兔IgG，Frdbio，Cat No.:SAB90200H）,37孵育1h。

5）取出拍幹，洗滌液洗板3次，每孔加入100μl單組份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室溫孵育5～20min（根據顏色的改變速度）。

6）每孔加入50μl終止液（0.5M H2SO4）。

7）在酶標儀上讀取450nm/630nm的吸光度。

標準的結果分佈模式應該如上圖所示： ELISA酶標板顯色由陰陽性區域第一行第一列孔向外顯均勻放射狀遞減；如果在包被梯度方向上OD450過高無梯度，應該繼續降低包被濃度；反之，則增加。同理，如果在免疫血清稀釋度方向上OD450過高無梯度，則應繼續加大稀釋度，反之，則減小。

8)最佳包被濃度的確定:

陽性血清區域內某個孔對應的OD值與其上/其左孔OD值恰好為2倍關系且OD值不低於1.2,且此孔對應的陰性血清區域OD值與空白對照孔OD值無差異，此孔包被的抗原濃度的2倍確定為抗原的最佳包被濃度。同理也可以參照此方法確定陽性血清的最佳稀釋倍數。

如果方陣滴定的數值結果不能如圖分佈，則需要重新設計方陣實驗。

9）以最佳包被濃度將抗原按照上述方法包被到酶標板同時封閉，將陰性/陽性血清依次倍比稀釋，100μl加到酶標板孔（最好做復孔），然後依次加入二抗、底物顯色，讀取OD值。對應稀釋度陰性血清OD值的2.1倍確定為陽性值，也稱Cut-off值，這個是檢驗學上的常用方法，而往往制備抗體的高免血清的稀釋度都比較高，其對應稀釋度的陰性血清值接近於空白值，所以這個判斷方法作為ELISA稀釋終點沒有意義，Frdbio定義ELISA終點方法為：OD值-空白值或陰性對照值0.100（前提條件是空白孔值/陰性對照孔OD值﹤0.050），可以根據自己的實驗室具體情況自己確定合適的終點判定標準。

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動物免疫血清采集與保存抗體效價檢測達到預期要求即可進行動物血清收集，下面以最常用的兔頸動脈放血的SOP為例進行敘述。SOP19 兔頸動脈放血與血清分離1） 將免疫兔仰面固定於固定架上，頭部放低，暴露頸部。2） 沿中部中線用2%普魯卡因液局部麻醉，15min後剪開頸中部皮膚10cm長。沿氣管鈍性分離皮下組織，暴露氣管前的胸鎖乳突肌。3） 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角疏松組織，肌束下面靠近氣管兩側，找到頸部動脈（鮮紅色搏動），分離頸動脈，兩根棉線分別套入頸動脈，其中一根紮緊在頸動脈的遠心端，另外一根暫時不紮。4） 腹腔內註射1mg腎上腺素。5） 止血鉗夾緊頸動脈近心端血管，用眼科剪刀在棉線紮系結與止血鉗之間血管側面剪開一個小口，將采血針塑料管向近心端方向插入，並紮系固定塑料管，將塑料管裸露的一頭引入離心管並固定，松開近心端止血鉗，血液就可以噴入離心管。6） 太高固定架尾部，同時擠壓心臟，可以增加取血量，一般每隻兔子可以缺血80～100ml。7） 將血清放在室溫1h,然後放在4過夜，使血塊收縮。8）將離心管放入離心機，4 2,500rpm離心30min，收取上層血清。 血清的保存將以上獲取的抗血清加入0.01%硫柳汞後者0.1%疊氮化鈉，可於4保存3個月，後者加入30%甘油-20以下保存，建議分裝成小管，避免反復凍融。四、抗血清效價的測定抗血清效價的測定除瞭以上的ELISA方法，還可以用瓊脂擴散實驗來進行。SOP20 瓊脂擴散實驗檢測抗血清效價1） 稱取1.0g瓊脂糖融解在100ml PBS(pH7.4)貨0.85%生理鹽水中。2） 將瓊脂糖趁熱倒在幹凈的玻片或平皿上，瓊脂厚度約3mm。3） 待其冷卻,在其上按照梅花形排佈到處3～5mm小孔，並挑出空中瓊脂。4） 在中間孔加入1mg/ml的抗原，加滿不要溢出到其他孔。5） 周邊孔分別加入用生理鹽水依次被比稀釋的抗血清。6） 加好後將玻片或平皿放入濕盒置於37孵育過夜。次日取出，在散射光下，稀釋的抗體與中心抗原孔之間有白色沉淀線為陽性，否則為陰性。

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